酵母朊蛋白Sup35NM及其變異體體外淀粉樣纖維形成動態(tài)及其細(xì)胞毒性作用.pdf

1、本文為明確N區(qū)特殊的氨基酸組成及序列在淀粉樣纖維形成中的作用，構(gòu)建了Sup35NM的變異體，分析了它們淀粉樣纖維形成的動力學(xué)過程，并進(jìn)一步探討了野生型Sup35NM及其變異體聚集物的細(xì)胞毒性作用，以期為闡明淀粉樣纖維形成及其致病機制提供線索。 1.酵母朊蛋白Sup35NM變異體體外淀粉樣纖維形成的動態(tài)研究為了闡明氨基酸序列對纖維形成的影響，首先將Sup35NM片段的PrD的氨基酸序列重新隨機排列同時保證氨基酸的組成及M段的氨基酸

2、序列不變，構(gòu)建了5個Sup35NM的變異體，分別稱為Sup35NM-1、-2、-3、-4、-5。在E. coli中成功表達(dá)、純化了野生型Sup35 NM及其5個變異體，進(jìn)而研究了其在體外淀粉樣纖維形成的動力學(xué)過程。結(jié)果顯示：透射電子顯微鏡下觀察可見Sup35NM及其5種變異體蛋白在PBS(pH7.4)緩沖液中均可發(fā)生聚集，2h時可見球形顆粒、寡聚體及少量短而細(xì)的纖維，18h時Sup35NM、Sup35NM.1、-2、-3蛋白溶液中出現(xiàn)大

3、量的成熟纖維，球形顆粒消失，纖維長且邊緣光滑，Sup35NM-4、-5除了長纖維以外，還可見蛋白寡聚體和球形顆粒。48h后，Sup35NM及5個變異體蛋白溶液中只有大量成熟纖維，直徑約8～14 nm。用圓二色譜檢測了其二級結(jié)構(gòu)，顯示在216nm附近出現(xiàn)一負(fù)峰，呈典型的β-折疊特征，提示該過程伴隨蛋白結(jié)構(gòu)由α-螺旋到β-折疊的轉(zhuǎn)變。NM及變異體聚集所形成的纖維分別經(jīng)1μg/ml和4μg/ml的蛋白酶K作用60min后仍可檢測到蛋白的存在，

4、說明纖維具有較強的抗蛋白酶K消化的特性。ThT結(jié)合試驗顯示，Sup35NM-1、-2、-3與Sup35NM熒光強度上升的速度相似，經(jīng)歷一個快速上升期后達(dá)到平臺期，未見明顯的潛伏期，而Sup35NM-4、-5則能觀察到一個近5h的潛伏期，提示Sup35NM-4、-5蛋白聚集明顯慢于Sup35NM及其它變異體蛋白。SDS-PAGE電泳和Westem blotting也進(jìn)一步證明，纖維形成過程中蛋白單體逐漸減少同時多聚體則逐漸增加。淀粉樣纖維

5、經(jīng)沸水浴加熱后發(fā)現(xiàn)纖維消失，代之以大量的球形顆粒、寡聚體及少量短棒狀纖維，ThT結(jié)合試驗顯示纖維加熱后熒光強度明顯下降，SDS-PAGE電泳也證實加熱后蛋白單體重新出現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)說明PrD的氨基酸序列被隨機打亂后并沒用影響其最終形成淀粉樣纖維的能力，并且變異體形成的纖維具有與野生型Sup35NM的纖維具有相同的形態(tài)和生化特征，但纖維形成的速率有所不同，提示形成纖維的能力是由氨基酸組成決定的，特定的氨基酸序列在一定程度上調(diào)節(jié)纖維形成的速率

6、。 2.野生型Sup35NM及其變異體蛋白纖維的構(gòu)象誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變作用已有研究表明，在體內(nèi)Rnqlp、polyQ等聚集體可誘導(dǎo)酵母菌株從[PSI<'->]轉(zhuǎn)變?yōu)閇PSI<'+>]，在體外異源性的Rnql或polyQ“種子”可促進(jìn)NM形成淀粉樣纖維。我們構(gòu)建的變異體N區(qū)同野生型NM一樣富含Q/y，為了進(jìn)一步闡明富含Q/N的異源性“種子”能促進(jìn)蛋白的聚集，我們研究了野生型NM與變異體的相互誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變以及另一個酵母朊蛋白Ure2對NM和變異體

7、纖維形成的影響。結(jié)果顯示：野生型Sup35NM“種子”可加快變異體Sup35NM-1、-4、-5的纖維形成，反之亦然。此外，異源的Ure2“種子”也能輕度增加NM及變異體的轉(zhuǎn)變速率，但總的來說異源性的“種子”比自體“種子”的誘導(dǎo)效率相對低一些。而沒有Q/N結(jié)構(gòu)域的α-synuclein“種子”則對蛋白聚集的速率無影響。這些結(jié)果提示富含Q/N結(jié)構(gòu)域的異源性“種子”盡管其氨基酸序列不同，能夠促進(jìn)同樣含有Q/N結(jié)構(gòu)域的蛋白的聚集，而不含Q/N

8、的異源“種子”則無此作用。 3.野生型Sup35NM及其變異體對哺乳動物細(xì)胞的毒性目前已有大量研究證實，在多種蛋白聚集過程中形成的中間體有細(xì)胞毒性。Sup35p是釀酒酵母中的朊蛋白，可發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變形成淀粉樣纖維，與哺乳動物Prion蛋白不同，不會引起酵母死亡，與人類淀粉樣疾病無關(guān)，Sup35的聚集中間體是否具有細(xì)胞毒性作用還沒有得到證實。為證實Sup35NM聚集體的細(xì)胞毒性，我們將純化的蛋白(64μmol/L)于室溫下放置0.5

9、～1h或于4℃放置2d～4d后，分別獲得聚集中間體和成熟纖維，然后將不同形態(tài)的蛋白分別作用于Vero、NIH-3T3、SH-SY5Y細(xì)胞系。此外，研究了變異體的毒性作用。結(jié)果顯示：Sup35NM及其變異體的聚集中間體對細(xì)胞具有毒性作用，可明顯降低細(xì)胞存活率，這種毒性作用與劑量具有相關(guān)性，成熟纖維反而無害，與其它蛋白相似。這一結(jié)果提示蛋白聚集體的細(xì)胞毒性可能與其結(jié)構(gòu)相關(guān)。不同細(xì)胞系對蛋白毒性的敏感性有差異，Vero和NIH-3T3細(xì)胞比較