α-共核蛋白在錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性中的作用及其可能機(jī)制.pdf

1、研究背景慢性錳中毒主要病理進(jìn)程是選擇性的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的退行性變性，導(dǎo)致紋狀體多巴胺(DA)的耗竭，引起錐體外系功能失調(diào)。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)揭示錳可能是一種多巴胺能神經(jīng)毒素，其產(chǎn)生的功能性損傷與自發(fā)性帕金森病(PD)錐體外系的表征和癥狀緊密相關(guān)。 α-共核蛋白(α-SYN)由140個(gè)氨基酸組成，為1988年Maroteaux等在用純化的抗突觸囊泡的抗血清從電鰻體內(nèi)表達(dá)篩選cDNA文庫時(shí)得到的一種新蛋白質(zhì)，為人類阿爾茨海

2、默病(AD)淀粉樣斑塊中非Aβ蛋白的前體蛋白，脊椎動(dòng)物的α-SYN高度保守。自從發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病病理過程相關(guān)聯(lián)，越來越多的實(shí)驗(yàn)試圖揭示α-SYN的生理功能及其與其他蛋白之間的相互關(guān)系。目前，關(guān)于這種蛋白的生理功能還不清楚，有研究提示該蛋白與神經(jīng)元的突觸可塑性有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)其可能是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要成員。過去的幾年中，許多研究證實(shí)α-SYN在Lewy小體病和帕金森病的發(fā)病機(jī)制中起到了關(guān)鍵的作用，然而α-SYN在錳神經(jīng)毒性作用

3、中的機(jī)制尚不清楚。 絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及胞核內(nèi)的過程中，通過絲/蘇氨酸磷酸化，參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等極其重要的生物學(xué)反應(yīng)。其中，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要參與細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控。而JNK及p38通路多在應(yīng)激條件下激活，可能與細(xì)胞應(yīng)激時(shí)的多種病理生理過程有關(guān)，而且并行的MAPKs信號(hào)通路相互協(xié)調(diào)、相互調(diào)控。 近年來，錳神經(jīng)細(xì)胞毒性作用的研究受到了廣泛關(guān)注。初步的研究結(jié)果認(rèn)為較低劑

4、量的錳(0.03mM)短時(shí)間作用于神經(jīng)細(xì)胞，其磷酸化ERK表達(dá)水平增高，但也有降低的報(bào)道，同時(shí)錳引發(fā)了磷酸化JNK表達(dá)水平的升高。24h和48h的細(xì)胞生存活力實(shí)驗(yàn)表明錳可使細(xì)胞增殖抑制。由于實(shí)驗(yàn)條件不同，研究結(jié)果不盡一致。 基于以往的實(shí)驗(yàn)事實(shí)，我們以多巴胺能的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究錳對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。篩選錳對(duì)PC12細(xì)胞增殖抑制作用的時(shí)間及劑量關(guān)系，探討在此過程中α-SYN蛋白表達(dá)水平的變化及其引

5、起細(xì)胞毒性的可能機(jī)制，旨在尋找錳等PD相關(guān)環(huán)境危險(xiǎn)因子對(duì)基底神經(jīng)節(jié)損傷作用的分子機(jī)制，以期揭示錳中毒等神經(jīng)退行性疾病的病因?qū)W基礎(chǔ)，為臨床預(yù)防和治療錳中毒及其他神經(jīng)退行性疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法取對(duì)數(shù)生長期PC12細(xì)胞，使用含有0、100、300、500、700、900μmol/LMnCl2的DMEM培養(yǎng)液，分別作用1-7天后，用噻唑藍(lán)(MTT)比色試驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的生長和增殖情況，臺(tái)盼藍(lán)染色法繪制細(xì)胞生長

6、曲線，篩選錳的細(xì)胞毒性劑量；Westernblot法檢測染錳后細(xì)胞α-SYN表達(dá)水平的變化；用pcDNA3.1(+)-sense-α-syn質(zhì)粒和pcDNA3.1(-)-antisense-α-syn質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，MTT法觀察α-SYN蛋白表達(dá)水平的變化在錳誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性中的作用；Westernblot法檢測染錳后PC12細(xì)胞ERK1/2和JNK1/2蛋白磷酸化水平的變化；采用ERK和JNK通路阻斷劑抑制ERK和JN

7、K蛋白磷酸化水平后westernblot法檢測α-SYN表達(dá)水平的變化；并用westernblot法檢測α-SYN蛋白表達(dá)水平的變化對(duì)染錳PC12細(xì)胞中ERK1/2和JNK1/2蛋白磷酸化水平的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示100-900μmol/LMnCl2作用1-7天均對(duì)PC12細(xì)胞有抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，而且300μmol/LMnCl2作用3天對(duì)PC12細(xì)胞的抑制率可達(dá)50％(P＜0.05

8、)。Westernblot結(jié)果顯示100、300、500μmol/LMnCl2作用3天可見隨著染錳濃度的升高，α-SYN蛋白表達(dá)水平逐漸升高，與對(duì)照組相比，蛋白表達(dá)水平分別升高了1.82、4.52、7.34倍(P＜0.05)。 將pcDNA3.1(+)-sense-α-syn和pcDNA3.1(-)-antisense-α-syn分別轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中，觀察α-SYN表達(dá)水平的改變對(duì)錳神經(jīng)毒性的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比

9、，α-SYN含量增加對(duì)PC12細(xì)胞的生長增殖有抑制作用(P＜0.05)，α-SYN含量增加可加重錳對(duì)PC12細(xì)胞的生長增殖抑制(P＜0.05)，而α-SYN含量降低則可減輕錳對(duì)PC12細(xì)胞的生長增殖抑制(P＜0.05)。 100、300、500μmol/LMnCl2作用3天可見ERK1/2磷酸化水平逐漸降低，蛋白表達(dá)水平分別為對(duì)照組的61.6％、46.8％、24.4％(P＜0.05)，呈逐漸降低趨勢(shì)；JNK1/2磷酸化水平逐漸升

10、高，蛋白表達(dá)水平分別比對(duì)照組升高了1.91、2.86、4.13倍(P＜0.05)；提示ERK1/2磷酸化水平的降低和JNK1/2磷酸化水平的增高引起細(xì)胞增殖抑制。用ERK和JNK通路特異性阻制劑PD98059和SP600125預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果顯示對(duì)α-SYN表達(dá)沒有顯著影響(P＞0.05)。300μmol/LMnCl2作用3d時(shí)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-sense-α-syn的染錳PC12細(xì)胞隨著α-SYN表達(dá)的增高(為對(duì)照組的1.

11、25倍，P＜0.05)，與對(duì)照組相比，p-ERK1/2表達(dá)水平降低(為對(duì)照組的34.7％，P＜0.05)，p-JNK1/2表達(dá)水平升高(為對(duì)照組的4.21倍，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-antisense-α-syn質(zhì)粒的染錳PC12細(xì)胞隨著α-SYN表達(dá)水平的降低(為對(duì)照組的31.5％，P＜0.05)，與對(duì)照組相比，p-ERK1/2表達(dá)水平升高(為對(duì)照組的4.22倍，P＜0.01)，p-JNK1/2表達(dá)水平降低(為對(duì)照

12、組的39.7％，P＜0.05)，提示染錳PC12細(xì)胞α-SYN表達(dá)水平的變化可能誘導(dǎo)了p-ERK1/2及p-JNK1/2表達(dá)水平的變化，繼之誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。 結(jié)論一定濃度的錳對(duì)PC12細(xì)胞生長、增殖具有顯著的抑制作用，誘導(dǎo)α-SYN表達(dá)增高可能是錳的神經(jīng)毒作用機(jī)制之一。我們的研究結(jié)果提示α-SYN表達(dá)水平的升高對(duì)PC12細(xì)胞的生長增殖具有抑制作用，而誘導(dǎo)α-SYN表達(dá)水平增高可能在MnCl2引起的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞毒性中起重要作用，