豬嵴病毒、豬星狀病毒和豬環(huán)曲病毒的多重RT-PCR檢測方法的建立及初步應用.pdf

1、由病毒感染導致豬腹瀉的生豬肉可通過市場流通傳染給人的潛在危害逐漸引起人們的高度關注，尤其是近些年來新發(fā)現的，且研究還不夠完善的病毒。如今豬嵴病毒(porcine kobuvirus，PKV)、豬環(huán)曲病毒(porcine torovirus，PToV)、豬星狀病毒(porcine Astroviride，PAstV)在腹瀉豬體內檢出率高，并且與它們同屬的其他病毒也有報道在腹瀉或腸道病人體內發(fā)現，故也增加了PKV、PToV、PAstV對感染

2、人這一潛在風險的研究價值。但是這三種病毒的流行病學和臨床癥狀極為相似，在臨床和病理學上很難區(qū)分。為了進一步研究這三種可能致豬腹瀉的病毒，本研究建立了能同時檢測這三種病毒的多重RT-PCR檢測方法，并對四川某屠宰場的豬肉和豬的腸道內容物進行采樣和初步檢測試驗。其主要結果如下:
　　1.PKV、PAstV和PToV的多重RT-PCR檢測方法的建立
　　根據GenBank登錄的PKV3D基因、PAstV ORE2基因、PToVM基

3、因，利用軟件Primer5.0分別設計了三對特異性引物。預計擴增大小分別為358bp、938bp和718bp的片段。先分別建立了針對各病毒的單項RT-PCR檢測方法，在此基礎上，經過反應條件和反應程序的優(yōu)化，建立了一種能夠同時檢測PKV、PAstV和PToV的多重RT-PCR的方法，能從PKV、PAstV和PToV的陽性模板中同時擴增出與目的片段大小相符的3條特異性條帶;并將多重RT-PCR和單項RT-PCR方法進行了比較。敏感性試驗中

4、，多重RT-PCR檢測方法能夠檢測到PKV、PAstV和PToV的最低濃度分別約為1.51×104拷貝/μL、1.19×103拷貝/μL、1.26×104拷貝/μL;對同一模板進行了五次檢測，與單項RT-PCR結果一致。結果表明，本方法具有很好的特異性、敏感性和重復性;同時具有快速、準確的特點，可用于PKV、PAstV和PToV的檢測。
　　2.多重RT-PCR檢測方法的初步應用
　　用多重RT-PCR檢測方法對屠宰場隨機采

5、取20頭豬的豬肉進行PKV、PAstV、PToV檢測，結果顯示20份豬肉均未檢出;對四川部分地區(qū)豬場的96份屠宰生豬的腸內容物進行采樣，運用建立的多重RT-PCR方法對其進行檢測，結果統(tǒng)計分析發(fā)現PKV、PAstV、PToV的陽性檢出率分別為47％、15％，11％，不同交叉混合感染的有23份，其中12份檢出PKV和PAstV混合感染，5份PKV和PToV混合感染，4份PAstV和PToV混合感染，2份樣品同時檢測出三種病毒感染。該方法的