Nampt-visfatin對(duì)血小板的作用及抗血栓藥效學(xué)平臺(tái)建設(shè).pdf

1、研究目的：
　　 以前，脂肪組織一直只是被單純的認(rèn)為是能量的一個(gè)儲(chǔ)存器官，隨著近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞產(chǎn)生各種各樣的分泌蛋白，也就是脂肪細(xì)胞因子(adipocytokines)。這些脂肪細(xì)胞因子在生物體的生命代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前為止，脂肪組織已成為人體最大的內(nèi)分泌器官。煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)是生物體內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸

2、(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)重要的合成酶，是內(nèi)臟脂肪分泌的由491個(gè)氨基酸組成，分子量為52KD的一種脂肪細(xì)胞因子，主要在內(nèi)臟脂肪中表達(dá)，因此也被稱為內(nèi)臟脂肪素visfatin，同時(shí)在血液有核細(xì)胞、肝組織、腦、心、脾、胰、肌肉、骨髓、肺等器官和組織中表達(dá)。Visfatin 具有調(diào)節(jié)代謝、胰島素敏感性、心血管功能、炎癥免疫等多種功能活性。從原核生物到真核生物，由于內(nèi)臟脂肪素的氨基酸序列相當(dāng)

3、保守而都具有一定的同源性。
　　 Visfatin是2005年報(bào)道的脂肪因子，也是2001年和2002年分別發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌水平和哺乳動(dòng)物水平重要的酶Nampt。本教研室亦發(fā)現(xiàn)其在心血管領(lǐng)域方面具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖以及保護(hù)腦卒中的作用，visfatin 可通過(guò)其Nampt 酶活性反應(yīng)以及ERK、p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)血管平滑肌增殖，并確認(rèn)visfatin-SIRT1-AMPK是一條新的神經(jīng)保護(hù)通路而作為腦卒中防治的新靶點(diǎn)。綜合所

4、述，visfatin/Nampt在心血管領(lǐng)域與動(dòng)脈粥樣硬化、血管新生、血管平滑肌壽命與增殖、保護(hù)腦卒中具有重要作用，同時(shí)，與細(xì)胞凋亡、分化、炎癥、急性肺損傷、生物節(jié)律等具有重要聯(lián)系。
　　 Visfatin在生命代謝過(guò)程中發(fā)揮著如此眾多的重要的生物學(xué)功能，但目前還沒(méi)有任何visfatin 關(guān)于血小板功能方面的報(bào)道。因此我們?cè)噲D尋找visfatin與血小板功能方面的聯(lián)系，研究visfatin是否在血小板內(nèi)部表達(dá)？通過(guò)外源性的加入v

5、isfatin 重組蛋白及其抑制劑是否能夠影響血小板的功能？通過(guò)基因干預(yù)手段時(shí)visfatin/Nampt 過(guò)表達(dá)是否改變血小板功能？
　　 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法：
　　 實(shí)驗(yàn)一：Western blot 檢測(cè)血小板內(nèi)visfatin表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)二：正常大鼠取血離心得富血小板血漿(Platelet Rich Plasma,PRP)，分別用重組蛋白visfatin及其抑制劑FK866 孵育30min后測(cè)血小板聚集率

6、。
　　 實(shí)驗(yàn)三：SD大鼠腹腔注射FK866(0.5mg/kg)，上下午各一次，7天后取血測(cè)血小板聚集率。
　　 實(shí)驗(yàn)四：小鼠取血后體外孵育FK866 檢測(cè)ADP 引起的血小板表面P-Selectin表達(dá)。實(shí)驗(yàn)五：小鼠腹腔注射visfatin 抑制劑FK866(2.8mg/kg)，上下午各一次，3天后通過(guò)剪尾測(cè)出血時(shí)間，凝血時(shí)間及出血量。同時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)血小板表面P-selectin。
　　 實(shí)驗(yàn)六：內(nèi)臟脂肪

7、素過(guò)表達(dá)(NPT)及其酶突變(NPTA)和野生型(WT)小鼠剪尾測(cè)出血時(shí)間，凝血時(shí)間及出血量。并通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)血小板膜表面P-selectin。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過(guò)Western blot的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)visfatin在血小板中也有表達(dá)。
　　 2.體外PRP 血漿通過(guò)visfatin/Nampt 抑制劑FK866 孵育血小板聚集率顯著降低，證明在抑制visfatin/Nampt后，血小板聚集功能下降

8、。同時(shí)加入重組蛋白visfatin后，血小板聚集率顯著升高，血小板聚集功能增強(qiáng)。
　　 3.SD大鼠腹腔注射visfatin 抑制劑FK866，7天后取血檢測(cè)血小板聚集率，給藥組大鼠血小板最大聚集率較溶劑對(duì)照組降低。
　　 4.體外全血FK866 孵育后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ADP 引起的結(jié)合P-Selectin McAb 陽(yáng)性血小板百分率顯著降低。
　　 5.小鼠腹腔注射visfatin/Nampt 抑制劑F

9、K866，3天后通過(guò)剪尾測(cè)得出血時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)出血量增加。且ADP 引起的結(jié)合P-Selectin McAb 陽(yáng)性血小板百分率降低。
　　 6.內(nèi)臟脂肪素過(guò)表達(dá)(NPT)及其酶突變(NPTA)和野生型(WT)三組小鼠剪尾后NPT組較WT組出血時(shí)間縮短，出血量減少，且ADP 引起的結(jié)合P-Selectin McAb 陽(yáng)性血小板百分率升高，而NPTA組小鼠沒(méi)有明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 本研究檢測(cè)了visfati

10、n/Nampt及其抑制劑對(duì)血小板功能的影響，發(fā)現(xiàn)其抑制劑可以有效降低血小板的聚集率，降低ADP 引起的結(jié)合P-Selectin McAb 陽(yáng)性血小板百分率并抑制凝血功能。而外加重組蛋白visfatin/Nampt后，血小板聚集率升高。并且ADP 引起的過(guò)表達(dá)小鼠結(jié)合P-Selectin McAb 陽(yáng)性血小板百分率升高。
　　 因此，visfatin/Nampt 可能與血小板的激活存在著聯(lián)系，預(yù)示其可能在機(jī)體正常凝血功能的調(diào)控中起