DMXAA抗血小板、抗血栓作用和NOD2增強(qiáng)血小板活化和血栓形成的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 腫瘤血管破壞劑DMXAA的抗血小板、抗血栓作用及其機(jī)制
　　隨著我國(guó)人民生活水平的提高，動(dòng)脈血栓性疾病如冠心病和中風(fēng)等已超過(guò)惡性腫瘤成為導(dǎo)致國(guó)人死亡的首要疾病。血小板功能亢進(jìn)或異常激活引起的血管內(nèi)血栓形成是此類(lèi)疾病的病理基礎(chǔ)，抗血小板藥對(duì)其治療效果是肯定的。目前臨床上使用的抗血小板藥主要有環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林、P2Y12受體拮抗劑氯吡格雷、磷酸二酯酶(PDE)抑制劑西洛他唑、

2、和整合素αⅡbβ3受體拮抗劑阿昔單抗等，但由于存在阿司匹林抵抗和氯吡格雷抵抗等現(xiàn)象，導(dǎo)致現(xiàn)有的抗血小板藥對(duì)某些血栓性疾病患者臨床應(yīng)用受限，部分患者治療效果未盡如人意。因此，臨床仍需要抗血小板作用更強(qiáng)且副作用更小的藥物面世以改善某些動(dòng)脈血栓性疾病患者的療效，研究開(kāi)發(fā)此類(lèi)藥物仍具有較大的市場(chǎng)。
　　DMXAA作為腫瘤血管破壞劑治療非小細(xì)胞肺癌等已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，其主要通過(guò)破壞腫瘤組織血管導(dǎo)致腫瘤組織血供減少，從而達(dá)到抑制腫瘤作用。F

3、AA結(jié)構(gòu)與DMXAA類(lèi)似，顯著抑制小鼠來(lái)源腫瘤，但其作為腫瘤血管破壞劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其幾乎不抑制人來(lái)源腫瘤。在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)患者使用FAA治療時(shí)有明顯出血，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其具有抗血小板、抗血栓作用。雖然，臨床試驗(yàn)中使用DMXAA治療的患者未見(jiàn)明顯出血，其是否具有抗血小板、抗血栓作用也未見(jiàn)報(bào)道，但由于DMXAA與FAA結(jié)構(gòu)類(lèi)似，均屬于黃酮類(lèi)藥物，我們推測(cè)其具有與FAA類(lèi)似的抗血小板、抗血栓作用。因此，在本研究中，我們探討DMXAA是否具

4、有抗血小板、抗血栓作用，及其相應(yīng)機(jī)制。
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DMXAA在10-600μmol/L范圍內(nèi)濃度依賴(lài)性地抑制TXA2類(lèi)似物U46619誘導(dǎo)的阿司匹林處理或未處理的人血小板聚集和ATP釋放。300μmol/L DMXAA強(qiáng)烈抑制AA、ADP、膠原或瑞斯托酶素誘導(dǎo)的阿司匹林未處理的人血小板聚集和ATP釋放。通過(guò)給小鼠尾靜脈注射DMXAA，體外取血檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DMXAA也抑制U46619、AA、膠原或瑞斯托霉素誘導(dǎo)的小鼠血小板

5、聚集。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)DMXAA主要通過(guò)抑制血栓素合成酶導(dǎo)致血小板TXA2生成抑制，進(jìn)而抑制TXA2信號(hào)調(diào)控下游的Akt和Erk1/2蛋白磷酸化。另外，我們發(fā)現(xiàn)DMXAA也抑制血小板內(nèi)PDE。最后，我們采用FeCl3誘導(dǎo)的小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓模型和激光誘導(dǎo)的小鼠提睪肌動(dòng)脈血栓模型均發(fā)現(xiàn)DMXAA靜脈注射給藥顯著抑制體內(nèi)血栓形成。在與氯吡格雷口服給藥相同的抗血栓作用劑量下，DMXAA靜脈注射給藥小鼠未見(jiàn)明顯出血。
　　綜上所述，在本研究中

6、我們首次發(fā)現(xiàn)DMXAA具有強(qiáng)大的抗血小板、抗血栓作用，且沒(méi)有明顯的出血副作用，其抗血小板作用機(jī)制為抑制血栓素合成酶導(dǎo)致血小板TXA2生成抑制和PDE抑制導(dǎo)致血小板內(nèi)cAMP和cGMP水平升高。DMXAA已經(jīng)在臨床前期試驗(yàn)和Ⅰ期臨床試驗(yàn)中顯示藥物安全性好，因此有希望作為一個(gè)有效和安全的抗血小板藥物推向市場(chǎng)。
　　第二部分 NOD2增強(qiáng)血小板活化和血栓形成的作用及其機(jī)制
　　血小板的主要功能是參與生理性止血和病理性血栓，其功能亢

7、進(jìn)或異常激活可導(dǎo)致冠心病、中風(fēng)等動(dòng)脈血栓性疾病發(fā)生，在此過(guò)程中血小板表達(dá)的各種信號(hào)分子可顯著影響其活化過(guò)程。NOD(nucleotide binding oligomerization domain)作為白細(xì)胞中的眾多模式識(shí)別受體之一，包括NOD1和NOD2，其在機(jī)體對(duì)抗微生物入侵的天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。我們課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人和小鼠血小板表達(dá)NOD2，但不表達(dá)NOD1，MDP腹腔注射激活NOD2可增強(qiáng)野生型小鼠血小板對(duì)ADP

8、、凝血酶或膠原誘導(dǎo)的血小板聚集和ATP釋放，增強(qiáng)凝血酶誘導(dǎo)的野生型小鼠血小板凝塊收縮反應(yīng)，但幾乎不影響凝血酶誘導(dǎo)的NOD2基因敲除小鼠血小板凝塊收縮反應(yīng)，說(shuō)明NOD2在小鼠血小板活化過(guò)程中可能發(fā)揮作用，但對(duì)人血小板活化、體內(nèi)血栓形成的影響及相應(yīng)機(jī)制等尚未闡明。
　　在本部分中我們研究了采用MDP激活NOD2對(duì)人血小板活化、體內(nèi)血栓形成的影響及增強(qiáng)血小板活化的分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)MDP通過(guò)使血小板內(nèi)NOD2單體變成二聚體從而激活NOD

9、2。體外MDP激活NOD2濃度依賴(lài)性地增強(qiáng)凝血酶或膠原誘導(dǎo)的人血小板聚集和ATP釋放。體外MDP激活NOD2增強(qiáng)凝血酶誘導(dǎo)的人血小板凝塊收縮反應(yīng)，但幾乎不影響血小板在固相纖維蛋白原上鋪展。給FeCl3誘導(dǎo)的小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓模型小鼠腹腔內(nèi)注射MDP激活NOD2，顯示MDP可增強(qiáng)FeCl3誘導(dǎo)的野生型小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成，但幾乎不影響FeCl3誘導(dǎo)的NOD2基因敲除小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成。采用抗血小板血清去除小鼠體內(nèi)血小板，再輸入MDP

10、刺激或未刺激的血小板，最后尾靜脈注射膠原和腎上腺素誘導(dǎo)的肺栓塞模型小鼠觀(guān)察小鼠死亡情況，結(jié)果顯示輸注MDP刺激的野生型小鼠血小板可導(dǎo)致小鼠肺栓塞死亡率增高，而輸注MDP刺激的NOD2基因敲除小鼠血小板對(duì)小鼠肺栓塞死亡率幾乎不影響，說(shuō)明MDP激活血小板NOD2可導(dǎo)致小鼠肺栓塞死亡率增高，進(jìn)一步說(shuō)明MDP激活NOD2增強(qiáng)體內(nèi)血栓形成主要是通過(guò)激活血小板NOD2。小鼠斷尾出血量檢測(cè)顯示MDP激活NOD2可使野生型小鼠出血量減少，而在NOD2基

11、因敲除小鼠中則無(wú)此作用，溯MDP激活血小板NOD2也加速了血小板依賴(lài)的止血。進(jìn)一步研究機(jī)制，首次發(fā)現(xiàn)血小板表達(dá)受體相互作用蛋白-2（receptor-interacting protein2，RIP2），MDP激活血小板NOD2導(dǎo)致RIP2磷酸化增加，進(jìn)一步激活RIP2調(diào)控的下游MAPK信號(hào)通路和cGMP/PKG通路，從而發(fā)揮NOD2激活增強(qiáng)血小板活化的作用。
　　綜上所述，本部分研究揭示了MDP激活NOD2增強(qiáng)人血小板活化和體內(nèi)