核盤菌弱毒菌株AH16所含真菌病毒及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）可危害多種油料作物如油菜、大豆和向日葵等，引起菌核病。目前，開發(fā)有效控制核盤菌的措施仍然是值得探討的研究課題。一些真菌病毒可以導(dǎo)致核盤菌致病力發(fā)生衰退，對(duì)菌核病具有生防潛力。
　　本研究從安徽省油菜產(chǎn)區(qū)發(fā)病油菜莖稈內(nèi)菌核中分離得到一株核盤菌AH16。該菌株表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)緩慢、菌核產(chǎn)量少以及致病力低。深入研究發(fā)現(xiàn)AH6菌株攜帶有兩種病毒，即核盤菌線粒體病毒4(Scleroti

2、nia sclerotiorum mitovirus4，SsMV4/AH16)和核盤菌葡萄孢雙節(jié)段dsRNA病毒2（Sclerotinia sclerotiorum botybirnavirus2，SsBRV2）。SsBRV2為未報(bào)道的新病毒。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SsBRV2單獨(dú)感染時(shí)可以導(dǎo)致寄主致病力減弱。從轉(zhuǎn)錄組水平分析比較了SsBRV2和SsBRV1對(duì)于核盤菌基因表達(dá)的影響。本研究，一方面獲得了具有菌核病生物防治潛力的新真菌病毒;另一方面

3、，為認(rèn)識(shí)其導(dǎo)致核盤菌致病力衰退機(jī)制及研究葡萄孢雙節(jié)段RNA病毒與寄主真菌互作奠定了基礎(chǔ)。
　　核盤菌病毒SsMV4/AH16是一種+ssRNA病毒，其基因組全長(zhǎng)2752nt(GenBank登錄號(hào)為KT962974)，G+C含量為31％。5'啡翻譯區(qū)(UTR)包含471nt，3'-UTR包含85nt，含有一個(gè)大的開放性閱讀框(472～2667nts)，推定編碼一個(gè)730個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為85.27kDa，包含有一個(gè)保守RdR

4、p結(jié)構(gòu)域。BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)與SsMV4/NZ1在核苷酸序列上有93％的相似率，因此根據(jù)ICTV關(guān)于線粒體病毒種的界定，它們屬于同一種線粒體病毒。
　　SsBRV2的病毒粒子球形，直徑約40nm，其基因組由兩條dsRNA片段(L1和L2)構(gòu)成，其中L1-dsRNA為6159bp（GenBank登錄號(hào)為KT962972），L2-dsRNA為5872bp（GenBank登錄號(hào)為KT962973）。L1-dsRNA含一個(gè)ORF(ORF1

5、，nt413-6019)，5'-UTR長(zhǎng)為412bp，3'-UTR長(zhǎng)140bp;L2-dsRNA也含一個(gè)ORF(ORF2，nt412～5748)，5'-UTR長(zhǎng)為411bp，3'-UTR長(zhǎng)124bp。ORF1推測(cè)編碼的蛋白有1868個(gè)氨基酸，分子量大小是209kDa。將氨基酸序列用BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)含有一個(gè)保守的RdRp功能域(RdRp_4)。ORF2推測(cè)編碼的蛋白有1778個(gè)氨基酸，BLAST比對(duì)后未發(fā)現(xiàn)存在保守的功能域。SsBRV

6、2的ORF1推定的蛋白序列包含有一個(gè)保守的RdRp結(jié)構(gòu)域，經(jīng)過(guò)多重序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)SsBRV2的RdRp結(jié)構(gòu)域含有dsRNA病毒廣泛存在的8個(gè)保守motif。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明SsBRV2與核盤菌雙節(jié)段RNA病毒1(SsBRV1)、大豆葉際雙節(jié)段RNA病毒1(SlaBRV1)、灰葡萄孢雙節(jié)段RNA病毒1(BpRV1)等葡萄孢雙節(jié)段dsRNA病毒（Botyb irnavirus）4個(gè)病毒形成一個(gè)分枝，表明它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育上有緊密的親緣關(guān)系。

7、
　　通過(guò)PEG介導(dǎo)的方法將SsBRV2轉(zhuǎn)染至Ep-1PNA367R菌株。發(fā)現(xiàn)與Ep-1PNA367R相比，攜帶病毒的Ep-1PNA367RVT在致病力、菌絲生長(zhǎng)和菌落形態(tài)等方面存在顯著的差異，致病力明顯減弱，生長(zhǎng)速度變慢，不產(chǎn)生菌核。因此SsBRV2是一新的核盤菌弱毒相關(guān)病毒。
　　SsBRV2與早前報(bào)道的真菌病毒SsBRV1有著很近的親緣關(guān)系，但SsBRV1對(duì)寄主沒(méi)有顯著影響。為了在分子水平上研究?jī)煞N病毒對(duì)核盤菌基因表達(dá)

8、的影響，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)的方法將SsBRV2感染Ep-1PNA367，獲得攜帶SsBRV2的菌株Ep-1PNA367BRV2。對(duì)攜帶SsBRV1的Ep-1PNA367BRV1與Ep-1PNA367BRV2進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Ep-1PNA367BRV2的致病力明顯低于Ep-1PNA367BRV1的致病力，并且前者不產(chǎn)生菌核，而后者產(chǎn)菌核。
　　通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較了Ep-1PNA367、Ep-1PNA367BRV1和Ep-1PNA367

9、BRV2在轉(zhuǎn)錄水平上的異同，從轉(zhuǎn)錄組層面上解析兩種真菌病毒對(duì)核盤菌的影響。對(duì)Ep-1PNA367BRV2與Ep-1PNA367差異基因的GO注釋分析發(fā)現(xiàn)，其差異基因在45類生物學(xué)功能方面的基因表達(dá)有顯著差異（P≤0.05），而Ep-1PNA367BRV1與Ep-1PNA367相比，GO富集分析主要存在17類生物學(xué)功能方面的顯著差異(P≤0.05)。Ep-1PNA367BRV2與Ep-1PNA367之間差異基因的KEGG富集分析表明，顯著

10、性富集的通路有18個(gè)，其中涉及代謝通路的基因有92個(gè)，次級(jí)代謝合成的基因有44個(gè)。而Ep-1PNA367BRV1與Ep-1PNA367之間差異表達(dá)基因中顯著性富集(P≤0.05)的通路僅僅含有5個(gè)，沒(méi)有涉及到代謝通路和次級(jí)代謝合成，與前者共有的通路是蔗糖和淀粉代謝、半乳糖代謝和不飽和脂肪酸合成。表明兩種病毒對(duì)寄主的影響在轉(zhuǎn)錄水平有較大差異。
　　與Ep-1PNA367相比，Ep-1PNA367BRV2與Ep-1PNA367BRV1

11、中存在相同表達(dá)變化趨勢(shì)的差異基因有329個(gè)（上調(diào)175個(gè)，下調(diào)154個(gè)）。與Ep-1PNA367相比，相對(duì)于Ep-1PNA367BRV1的差異表達(dá)基因，Ep-1PNA367BRV2中，特異性變化的基因有1961個(gè)（其中單獨(dú)上調(diào)1174個(gè)，單獨(dú)下調(diào)679個(gè);Ep-1PNA367BRV2中上調(diào)Ep-1PNA367BRV1中下調(diào)86個(gè)，Ep-1PNA367BRV2中下調(diào)Ep-1PNA367BRV1中上調(diào)22個(gè)），GO注釋Ep-1PNA367B

12、RV2中特異變化的基因除了共同變化中的碳水化合物和水解酶外，還集中于氧化還原反應(yīng)、原血紅素結(jié)合、鐵結(jié)合和細(xì)胞壁修飾等方面。
　　對(duì)于特異性變化的基因從水解酶類基因、細(xì)胞色素P450基因、轉(zhuǎn)運(yùn)子基因、轉(zhuǎn)錄因子基因以及候選效應(yīng)因子基因進(jìn)行分析。水解酶基因中顯著下調(diào)55個(gè)，上調(diào)38個(gè);共有32個(gè)細(xì)胞色素基因的表達(dá)發(fā)生顯著上調(diào)或下調(diào);82個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)子基因發(fā)生特異性變化，其中28個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，54個(gè)基因表達(dá)上調(diào);38個(gè)轉(zhuǎn)錄因子大部分編碼鋅結(jié)合