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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:通過(guò)構(gòu)建腦缺血再灌注損傷的在體和細(xì)胞模型,研究腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)上皮特異性ETS-1(ESE1)的表達(dá)情況,探討其對(duì)神經(jīng)元凋亡可能的作用機(jī)制。
方法:采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制備大鼠全腦缺血再灌注模型,將健康雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注6h、12h、24h、48h、72h組。采用Western blot方法檢測(cè)ESE1、NF-κB活化指標(biāo)磷酸化p65(p-p65)及凋亡指標(biāo)active
2、 caspase3蛋白在腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織的表達(dá)情況;用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步研究ESE1在腦內(nèi)海馬CA1區(qū)的表達(dá)情況;通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)法明確腦內(nèi)ESE1在腦缺血再灌注后海馬組織腦細(xì)胞中的定位情況,以及與神經(jīng)細(xì)胞凋亡標(biāo)記物active caspase3的關(guān)系。同時(shí)采用二氯化鈷(CoCl2)刺激PC12細(xì)胞建立神經(jīng)元化學(xué)缺氧性損傷模型,檢測(cè)細(xì)胞缺氧后ESE1、p-p65和active caspase3蛋白表達(dá)的變化,隨后構(gòu)建E
3、SE1RNA干擾載體抑制PC12細(xì)胞中ESE1的表達(dá),檢測(cè)刺激后凋亡指標(biāo)active caspase3、p-p65等指標(biāo)的變化。
結(jié)果:
(一)在體實(shí)驗(yàn):①利用western blot發(fā)現(xiàn)ESE1、p-p65蛋白在假手術(shù)組中表達(dá)較低,腦缺血再灌注后6h表達(dá)開始上調(diào),24h達(dá)到高峰,隨后表達(dá)逐漸下降但仍高于假手術(shù)組水平;active caspase3蛋白在假手術(shù)組中表達(dá)很低,缺血再灌注后6h表達(dá)增多,并逐漸升高,48h
4、達(dá)到高峰,隨后表達(dá)有所回落但仍高于假手術(shù)組水平。②利用免疫組織化學(xué)方法結(jié)果顯示,假手術(shù)組海馬CA1區(qū)ESE1蛋白表達(dá)較低;與假手術(shù)組相比較,在腦缺血再灌注后24h海馬CA1區(qū)ESE1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多,表達(dá)增加,有顯著性差異。③利用免疫熒光雙標(biāo)法,結(jié)果顯示腦缺血再灌注24h海馬組織NeuN表達(dá)(+)細(xì)胞中ESE1表達(dá)為(+),GFAP表達(dá)(+)細(xì)胞中ESE1表達(dá)為(-),Iba表達(dá)(+)細(xì)胞中ESE1表達(dá)為(-),ESE1表達(dá)(+)
5、細(xì)胞中active caspase3表達(dá)為(+)。
?。ǘ╇x體實(shí)驗(yàn):采用western blot方法發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組ESE1、p-p65和active caspase3蛋白表達(dá)較低,與正常對(duì)照組相比較,ESE1、p-p65和active caspase3蛋白表達(dá)在CoCl2刺激PC12細(xì)胞1h后開始增多,逐漸上升,12h達(dá)到高峰,隨后下降但仍高于正常對(duì)照組;在干預(yù)PC12細(xì)胞中ESE1表達(dá)后,p-p65及active caspa
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