環(huán)黃芪醇對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡和TERT表達(dá)的影響.pdf

1、缺血性腦血管疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病之一，在缺血性腦血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中，會(huì)發(fā)生腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)，其嚴(yán)重影響疾病的治療和預(yù)后，因此加強(qiáng)對(duì)腦缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制及防治措施的研究成為一項(xiàng)重要的醫(yī)學(xué)課題。黃芪是一種被廣泛應(yīng)用于治療缺血性腦血管病的傳統(tǒng)中藥，在 IRI方面的防治作用日益被重視。環(huán)黃芪醇(cycloastragenol,CAG)是黃芪有效部位黃芪甲

2、苷的苷元，在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)有顯著的端粒酶激活作用，而端粒酶是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)措施，在腦缺血再灌注損傷中，過表達(dá)的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）能起到腦保護(hù)作用。環(huán)黃芪醇對(duì)腦缺血再灌注損傷有無保護(hù)作用及其機(jī)制尚不明確。本研究通過建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，術(shù)前給予環(huán)黃芪醇干預(yù)，通過檢測(cè)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死灶容積百分比，觀察環(huán)黃芪醇對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的減輕作用；通過

3、免疫組化和蛋白印跡法測(cè)定大鼠腦組織中TERT表達(dá)的變化和TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡的情況，探討環(huán)黃芪醇抑制神經(jīng)元凋亡、提高TERT的表達(dá)，從而減輕腦缺血再灌注損傷的分子機(jī)制，為環(huán)黃芪醇防治腦缺血再灌注損傷提供依據(jù)。
　　第一部分環(huán)黃芪醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的減輕作用
　　目的：
　　探討環(huán)黃芪醇對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的減輕作用。
　　方法：
　　1實(shí)驗(yàn)對(duì)象的分組與處理
　　選取60只雄性

4、SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，環(huán)黃芪醇低劑量組（2.5 mg/kg/d）、中劑量組（5.0 mg/kg/d）、高劑量組（10 mg/kg/d）和血塞通對(duì)照組（20 mg/kg/d），每組10只。每天灌胃給藥1次，連續(xù)7天，第7天給藥1h后進(jìn)行造模，假手術(shù)組和模型組給予等體積的0.5％CMC-Na混懸劑。
　　2.局灶性腦缺血再灌注模型的制備
　　采用Zea Longa線栓法略做改良制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模

5、型，缺血2h后拔出線栓，再灌注24h后，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。
　　3.大鼠Garcia JH神經(jīng)功能評(píng)分
　　再灌注損傷24h后，采用雙盲法，按照Garcia JH大鼠神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。
　　4.大鼠腦梗死灶容積百分比
　　再灌注損傷24h后處死大鼠，斷頭取腦，經(jīng)TTC染色，拍照，計(jì)算腦梗死灶容積百分比。
　　結(jié)果：
　　1.環(huán)黃芪醇對(duì)大鼠Garcia JH神經(jīng)功能評(píng)分的影響

6、　　與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低（P<0.01）；與模型組相比，環(huán)黃芪醇中、高劑量組的神經(jīng)功能評(píng)分均升高（P<0.05）；環(huán)黃芪醇低劑量組與模型組統(tǒng)計(jì)無差異（P>0.05）。
　　2.環(huán)黃芪醇對(duì)大鼠腦梗死灶容積百分比的影響
　　與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦梗死灶容積百分比顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，環(huán)黃芪醇中、高劑量組、血塞通組腦梗死灶容積百分比降低（P<0.05）；環(huán)黃芪醇低劑量組與模型組統(tǒng)計(jì)

7、無顯著性差異（P>0.05）。
　　小結(jié)：
　　環(huán)黃芪醇能提高腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，減小腦梗死灶容積百分比。環(huán)黃芪醇可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。
　　第二部分環(huán)黃芪醇對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡和TERT表達(dá)的影響
　　目的：
　　觀察環(huán)黃芪醇對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）表達(dá)的影響，探討環(huán)黃芪醇減輕腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。
　　方法：
　　檢測(cè)TERT蛋

8、白的表達(dá)：將雄性SD大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組、模型組、環(huán)黃芪醇組(10mg/kg/d)，除假手術(shù)組外，其余各組均進(jìn)行 MACO造模，給藥和造模方式同第一部分。在腦缺血再灌注24h后，以缺血側(cè)腦皮質(zhì)，半暗區(qū)為主要取材和觀察部位，通過免疫組織化學(xué)法和蛋白印跡法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)中TERT蛋白的表達(dá)。
　　檢測(cè)神經(jīng)元凋亡：將雄性SD大鼠隨機(jī)分成5組：假手術(shù)組、模型組、環(huán)黃芪醇組(10mg/kg/d)、端粒酶抑制劑疊氮胸苷(ATZ)組(

9、20mg/kg/d)、環(huán)黃芪醇(10mg/kg/d)+端粒酶抑制劑(ATZ)組(20mg/kg/d)。給藥和造模方式同上，腦缺血再灌注24h后，通過TUNEL染色法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)半暗帶區(qū)神經(jīng)元的凋亡指數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化法測(cè)定TERT蛋白的表達(dá)：與假手術(shù)組相比，模型組TERT的表達(dá)升高（P<0.05）。與模型組相比，環(huán)黃芪醇組TERT表達(dá)升高（P<0.05）。
　　2.Western blot法測(cè)定顯示：

10、與假手術(shù)組相比，模型組TERT蛋白的表達(dá)增加（P<0.05）；與模型組相比，環(huán)黃芪醇組TERT蛋白表達(dá)增加（P<0.05）。
　　3.TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況：與假手術(shù)組相比，模型組、端粒酶抑制劑組、端粒酶抑制劑+環(huán)黃芪醇組的凋亡指數(shù)（AI）均上升(P<0.01)；與模型組比較，環(huán)黃芪醇組凋亡指數(shù)（AI）明顯降低(P<0.05)；與環(huán)黃芪醇組相比，端粒酶抑制劑+環(huán)黃芪醇組凋亡指數(shù)（AI）上升(P<0.05)；與抑制劑組比

11、較，抑制劑+環(huán)黃芪醇組凋亡指數(shù)(AI)無顯著差異（P>0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.環(huán)黃芪醇能提高腦缺血再灌注大鼠腦組織TERT的表達(dá)，推測(cè)此為環(huán)黃芪醇減輕腦缺血再灌注損傷作用的機(jī)制之一。
　　2.環(huán)黃芪醇能抑制腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡，該作用是通過促進(jìn)TERT表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　1.環(huán)黃芪醇能提高腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，減小腦梗死灶容積百分比，減輕缺血再灌注腦組織的損傷。