硝普鈉對(duì)高膽固醇血癥兔Oddi括約肌鉀離子通道的影響.pdf

1、目的:
　　 Oddi括約肌功能障礙(sphincter of Oddi dysfunction，SOD)是指由于Oddi括約肌(sphincter of Oddi，SO)運(yùn)動(dòng)異常導(dǎo)致的膽汁、胰液排出受阻，膽管、胰管內(nèi)壓升高，繼而出現(xiàn)膽汁淤積、胰源性腹痛或急性胰腺炎等臨床癥狀的一種疾病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇血癥(hypercholesterolemia，HC)可導(dǎo)致兔SO壓力增高、舒張功能受損，與SOD時(shí)SO運(yùn)動(dòng)的改變相似

2、，提示高膽固醇血癥可能是原發(fā)性SOD的重要誘因。進(jìn)一步研究表明，高膽固醇血癥誘發(fā)SOD功能異常主要與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular calcium concentration，[Ca2+]i)超載密切相關(guān)。
　　 平滑肌細(xì)胞膜(smooth muscle cells，SMCs)存在多種鉀離子通道，其在維持細(xì)胞膜靜息電位方面起到重要作用。其中，電壓依賴(lài)性鉀離子通道(voltage-dependentpotassium

3、 channel，Kv)和大電導(dǎo)鈣激活型鉀離子通道(large conductancecalcium-activated potassium channel，BKca)在數(shù)量上占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其作為L(zhǎng)型電壓依賴(lài)性鈣離子通道（L-type voltage-dependent calcium channel，L-VDCC）的重要上游調(diào)控通道，對(duì)L-VDCC的功能狀態(tài)起到重要影響，進(jìn)而影響[Ca2+]i，調(diào)節(jié)平滑肌張力變化。
　　 既往

4、研究表明，一氧化氮(nitric oxide,NO)供體單硝酸異山梨酯有舒張兔Oddi括約肌的作用，免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)NO合成酶在哺乳動(dòng)物及人的SO組織中廣泛存在，其功能對(duì)于SO運(yùn)動(dòng)功能起到顯著影響，這表明NO可能在調(diào)節(jié)Oddi括約肌功能方面起到重要作用，但其具體機(jī)制尚不明確。
　　 本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn)，通過(guò)飼喂高膽固醇飲食建立高膽固醇血癥兔模型模擬SOD狀態(tài)，采用等長(zhǎng)張力記錄的方法觀(guān)察外源性NO供體硝普鈉(sodiumnit

5、roprusside，SNP)對(duì)不同鉀離子通道阻滯劑預(yù)處理的SO肌環(huán)的舒張作用，通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western blot)及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)觀(guān)察通道蛋白表達(dá)的變化，并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)SO平滑肌的磷酸激酶C(phosphate

6、kinase C，PKC)活性，初步探討NO在調(diào)控Oddi括約肌運(yùn)動(dòng)方面的可能機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 一、硝普鈉對(duì)高膽固醇血癥兔Oddi括約肌張力及鉀離子通道的影響
　　 將24只新西蘭大白兔隨機(jī)分為對(duì)照組(CON)、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)實(shí)驗(yàn)組及鹽酸四乙胺(tetraethylammonium，TEA)實(shí)驗(yàn)組，給予高膽固醇飲食飼喂8周，通過(guò)等長(zhǎng)張力記錄方法，觀(guān)察SO肌環(huán)

7、對(duì)鉀離子通道阻滯劑4-AP和TEA的收縮反應(yīng)，并觀(guān)察比較SNP對(duì)各組SO肌環(huán)的舒張作用。
　　 二、硝普鈉對(duì)高膽固醇血癥對(duì)兔Oddi括約肌Kv1.5及BKca通道蛋白及PKC活性的影響
　　 將新西蘭大白兔16只采用完全隨機(jī)分組方法，分為對(duì)照組(CON)、對(duì)照組+NO(CON+NO)，高膽固醇血癥組(CH)、高膽固醇血癥+NO(CH+NO)組共4組，給予后兩組高膽固醇飲食飼喂8周，對(duì)照組給予普通飲食，成功建立模型后，給予

8、CON+NO組和CH+NO組兔腹腔注射硝普鈉5mg/Kg，隔天再給藥一次，24h后分別取相應(yīng)組別Oddi括約肌組織。通過(guò)HE染色觀(guān)察各組組織形態(tài)學(xué)變化，通過(guò)Western Blot及RT-PCR實(shí)驗(yàn)觀(guān)察各組Kv1.5及BKca通道蛋白的表達(dá)，并通過(guò)Elisa實(shí)驗(yàn)觀(guān)察各組PKC活性變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、動(dòng)物模型構(gòu)建情況
　　 飼喂高膽固醇飲食的新西蘭兔飼喂8周后，各組血清總膽固醇均大于10mmol/L

9、，成功建立高膽固醇血癥模型。
　　 二、硝普鈉對(duì)高膽固醇血癥兔Oddi括約肌張力及鉀離子通道的影響
　　 SO肌環(huán)初始收縮平均波幅為（0.144±0.004）g，平均收縮頻率為（10.8±1.1）次/min。累積濃度4-AP對(duì)SO肌環(huán)有收縮作用，收縮頻率較對(duì)照組減低(p＜0.05)，以16mmol/L為終濃度的4-AP組肌環(huán)對(duì)SNP舒張作用明顯低于對(duì)照組(p＜0.05)。累積濃度TEA也可明顯收縮SO肌環(huán)，收縮作用較對(duì)照

10、組明顯增大，收縮頻率較對(duì)照組減低(p＜0.05)。以10mmol/L為終濃度的TEA組肌環(huán)對(duì)SNP舒張作用同樣低于對(duì)照組(p＜0.05)。
　　 三、硝普鈉及高膽固醇血癥對(duì)SO平滑肌組織學(xué)影響的光鏡下觀(guān)察
　　 通過(guò)對(duì)各組組織的HE染色，在200倍光鏡下觀(guān)察可見(jiàn)各組SO肌排列整齊，均無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生，組織形態(tài)上無(wú)明顯異常。
　　 四、硝普鈉及高膽固醇血癥對(duì)兔Oddi括約肌Kv1.5及BKca通道蛋白

11、的影響
　　 高膽固醇血癥有導(dǎo)致SO平滑肌Kv1.5及BKca通道蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平降低的趨勢(shì)。NO有使SO平滑肌Kv1.5及BKca通道蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平升高的趨勢(shì)。
　　 五、硝普鈉及高膽固醇血癥對(duì)兔Oddi括約肌PKC活性的影響
　　 高膽固醇血癥可致SO蛋白磷酸化水平增高，NO有使PKC活性下降趨勢(shì)，其在CH組作用更明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1、外源性NO供體SN

12、P可能部分通過(guò)Kv及BKca通道發(fā)揮舒張SO肌環(huán)的作用。
　　 2、HC可導(dǎo)致SO平滑肌Kv1.5及BKca通道蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平降低，NO可提高SO平滑肌Kv1.5及BKca通道蛋白及mRNA表達(dá)水平，這可能是NO舒張SO肌環(huán)的機(jī)制之一，這對(duì)于NO供體藥物治療SOD靶點(diǎn)提供了新的依據(jù)。
　　 3、HC可使SO蛋白PKC活性增高，既往研究表明PKC有抑制Kv及BKca通道活性作用，NO有使PKC活性下降的趨勢(shì)