慢性便秘患者腸道菌群對小鼠腸道5-羥色胺轉(zhuǎn)運體表達及排便功能的影響.pdf

1、目的：
　　慢性便秘（chronic constipation）是一種常見下消化道疾病，表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、糞便干結(jié)及排便困難，病程至少6個月。慢性便秘是常見的功能性胃腸病，人群發(fā)病率較高，癥狀持續(xù)反復，嚴重影響患者的身心健康及生活質(zhì)量。慢性便秘的發(fā)病機制尚不清楚，近年來，已有研究表明慢性便秘患者的腸道菌群數(shù)量和種類較正常健康人有所改變，并且應用抗生素和微生態(tài)制劑可以緩解便秘癥狀，但其機制尚未明確。5-羥色胺（5-hydroxy

2、tryptamine，5-HT）是腦一腸軸的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，人體90％以上的5-HT由腸道合成。腸道合成的5-HT調(diào)節(jié)多種功能，包括腸道分泌、腸道運動和胃腸感覺功能。5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（serotonin transporte, SERT）是一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛分布于腸道嗜鉻細胞(enterochromaffin cells, EC cells)及神經(jīng)突觸前膜上，可將效應部位過多聚集的5-羥色胺再攝取，從而終止5-HT的作用。5-羥色胺和

3、5-羥色胺轉(zhuǎn)運體在慢性便秘的發(fā)病中有著重要的作用。研究表明，腸道微生態(tài)環(huán)境的改變可影響SERT的表達。本研究采用慢性便秘患者腸道菌群處理小鼠，評價對小鼠排便功能及腸道SERT表達的影響，旨在探討腸道菌群失調(diào)在慢性便秘發(fā)生過程中的作用及可能的機制。
　　方法：
　　本研究首先收集符合羅馬Ⅲ的診斷標準的慢性便秘病人和健康正常人的糞便，運用焦磷酸測序法分析腸道菌群。將20只6周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠分為2組，每組10只，

4、一組為對照組，給予混合5個健康正常人的糞菌液灌胃，另一組為實驗組，給予混合5個慢性便秘患者的糞菌液灌胃。灌胃前連續(xù)給予3天鏈霉素25mg預處理構(gòu)建偽無菌鼠模型，繼而給予糞菌液灌胃，4-6日每日一次，之后隔日一次，共7次，每只鼠每次250ul（濃度為1:10 g/ml），總共飼養(yǎng)的持續(xù)時間為15天。分別于第7天和第15天檢測首粒排黑便時間、2h排便粒數(shù)、2h糞便重量、2h糞便干重及糞便含水率；第15天每組5只小鼠行小腸推進實驗［實驗前一天

5、實驗小鼠禁食不禁水16h，每只小鼠依照重量給予印度墨汁(0.2 mL/10 g)灌胃，25min后處死小鼠，取小腸置于托盤上，測量小腸總長度及墨汁推進長度。小腸推進率=墨汁推進長度/小腸總長度×100%］。最后處死小鼠，取其結(jié)腸組織。分別應用Realtime-PCR和Western blot檢測小鼠結(jié)腸組織SERT mRNA和SERT蛋白表達，應用ELISA及免疫熒光方法檢測小鼠結(jié)腸組織5-HT的水平，觀察慢性便秘患者腸道菌群對小鼠腸道

6、組織SERT及5-HT水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.慢性便秘患者腸道菌群的多樣性比對照組明顯降低， F/B值（Firmicutes/Bacteroidetes）比對照組降低。比較某些重要的菌屬發(fā)現(xiàn)慢性便秘患者組腸道菌屬中雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、腸球菌（Enterococcus）、梭形桿菌屬（Fusobacterium）的比例升高，梭菌屬（Clostridium）、乳酸桿菌屬（ Lactobacill

7、us）、鏈球菌屬（ Streptococcus）、埃希-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）及脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）的比例降低。
　　2.慢性便秘患者腸道菌群對小鼠排便功能的影響：第7天的排便功能評價顯示，慢性便秘患者腸道菌群可使小鼠2h糞便重量顯著減少(271.86±32.72 vs223.24±47.50，P<0.05)，而首粒黑便排便時間(79.19±12.66 vs89.08±16.11，

8、P﹥0.05)、2 h排便粒數(shù)(15.42±2.63 vs13.55±3.12，P﹥0.05)、2h糞便干重(134.91±25.18 vs114.82±29.96， P﹥0.05)及糞便含水率(50.62%±5.42% vs48.88%±6.08%，P﹥0.05)無顯著變化。第15天的排便功能評價顯示，慢性便秘患者腸道菌群可使小鼠首粒黑便排便時間顯著延長(69.06±2.72 vs83.24±11.31，P<0.05)，2 h排便粒數(shù)

9、顯著減少(12.14±2.90 vs8.55±1.83，P<0.05)，2h糞便重量顯著減少(246.72±64.01 vs151.90±32.42，P<0.01)，2h糞便干重顯著減少(92.93±23.07 vs65.52±11.76， P<0.05)，糞便含水率顯著減少(61.95%±3.70%vs56.63%±3.01%，P<0.05)。
　　3.按照小腸墨汁推進率是否為100%（墨汁是否到達回盲部）進行比較，結(jié)果顯示實驗

10、組墨汁推進率為100%的例數(shù)顯著低于對照組(對照組5只小鼠小腸墨汁全部到達回盲部，實驗組5只小鼠中僅2只小鼠小腸墨汁到達回盲部，兩組差異有統(tǒng)計學意義(5/5 vs2/5，P<0.05)。
　　4.慢性便秘患者腸道菌群干預的實驗組小鼠腸道組織 SERT mRNA表達水平與健康正常人腸道菌群腸道菌群干預的對照組相比顯著增加（P<0.05）；實驗組SERT蛋白的表達水平比亦明顯高于對照組（P<0.05）。
　　5.慢性便秘患者腸道