酪蛋白飲食防止ECM發(fā)生的相關免疫機制研究.pdf

1、目前世界上有2.7億人患瘧疾，主要發(fā)生在撒哈拉以南非洲地區(qū)，每年新發(fā)病例200萬人，引起超過100萬人死亡，絕大多數(shù)是兒童。在瘧疾感染引起的各種臨床癥狀中，腦瘧（Cerebral Malaria，CM）引起的神經系統(tǒng)并發(fā)癥是最主要的死亡原因之一。營養(yǎng)不良影響著發(fā)展中國家近20％的人口，在撒哈拉以南非洲地區(qū)，有將近三分之一的五歲以下兒童因為營養(yǎng)不良而體重過輕和發(fā)育遲緩，低蛋白飲食是造成兒童營養(yǎng)不良的一個主要和常見原因。瘧疾感染會降低五歲以

2、下兒童的營養(yǎng)狀態(tài)，加重兒童營養(yǎng)不良的結局，營養(yǎng)不良也進一步增加瘧疾的易感性、發(fā)病率和死亡率。
　　 CM是由惡性瘧原蟲感染的紅細胞在腦組織微血管的沉積所引起的一系列并發(fā)癥。iRBCs和過強的炎癥應答是CM發(fā)生所必需的兩個條件。一般認為是iRBCs結合到微血管內皮上，引起全身性炎癥反應，但主要局限于iRBC沉積的部位，包括細胞因子、趨化因子、白細胞（T細胞和中性粒細胞）以及iRBCs參與微血管的病理損傷，促進ECM的發(fā)生，免疫病理

3、損傷的發(fā)生需要微血管循環(huán)或沉積的iRBCs持續(xù)刺激。CD4+T細胞產生的IFN-γ促進CD8+T細胞在腦組織的聚集。CD8+T細胞通過一種穿孔素依賴機制來介導CM的發(fā)生。盡管中性粒細胞不沉積在腦組織中，但其通過通過增加腦組織中前炎癥細胞因子尤其是IL-12的表達水平參與ECM的發(fā)生。IFN-γ能夠激活一些通路，尤其是IP10/CXCL10。TNF-α能夠抵抗瘧疾感染，殺傷瘧原蟲，但血清中高濃度的TNF-α與重癥瘧疾如CM發(fā)生密切相關。T

4、NF-α能夠誘導內皮細胞的活化，從而上調一些粘附分子如ICAM-1、CD36和VCAM-1的表達。其中ICAM-1參與iRBCs的粘附，iRBCs粘附在血管壁上會引起內皮細胞凋亡，引起血管通透性的改變及血腦屏障的破壞。TGF-β能夠通過增強IL-10的產生水平抑制TNF-α、NO以及IFN-γ的產生，最終可引起機體免疫應答從Th1型轉向Th2型。趨化因子能參與中樞神經系統(tǒng)的病理損傷。CXCR3的兩個配體CXCL9和CXCL10 mRNA

5、水平高度升高，參與ECM的發(fā)生。細胞粘附分子會促進趨化至血管部位的炎癥細胞與血管內皮的結合，從而導致細胞在腦部微血管的沉積。瘧色素可以活化MMP9基因參與CM的發(fā)生。
　　 脾臟中的免疫細胞如樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)、T細胞和巨噬細胞在控制瘧疾感染過程中發(fā)揮重要作用。DCs作為重要的抗原提呈細胞，能夠捕獲抗原，并在向淋巴組織T細胞區(qū)移行的過程中逐漸成熟，活化抗原特異性的T細胞?；罨腃D4+T細胞通過

6、分泌細胞因子如IFN-γ來促進對瘧原蟲的殺傷作用。Th1免疫應答在感染早期控制瘧疾感染方面具有重要作用，但同時也能引起CM的發(fā)生。作為平衡體內免疫應答一群重要細胞，Treg能夠通過分泌細胞因子如TGF-β和IL-10以及增加調節(jié)分子CTLA-4的表達抑制體內異?；蜻^強的T細胞應答，從而防止自身免疫性反應。瘧疾感染時，巨噬細胞可以直接吞噬感染的紅細胞，NO和活性氧簇有助于吞噬細胞如巨噬細胞在胞吞病原體之后對病原體的殺傷。
　　 酪

7、蛋白是牛奶蛋白質的主要組成部分，約占總蛋白的80％。作為新生兒生長所需要的氨基酸主要來源之一，酪蛋白飲食在體內會水解為很多功能肽，主要發(fā)揮免疫調節(jié)和抗菌作用。牛奶飲食尤其是其中的酪蛋白對P.berghei感染結局具有預防作用，酪蛋白經水解之后的多肽能夠調節(jié)免疫功能，來自αs1-、β-和κ-酪蛋白的肽片段能調節(jié)淋巴細胞增殖。然而，也有體外研究表明β-casomorphin-7和β-casokinin-10在高濃度時增強免疫功能，低濃度時抑

8、制免疫功能。阿片樣β-酪啡肽等免疫刺激劑能夠激活巨噬細胞的吞噬活性，并在T細胞的增殖和成熟過程中發(fā)揮重要作用。此外，αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的某些肽片段能抑制絲裂原誘導的人淋巴細胞和外周血單個核細胞的增殖，但在缺少絲裂原時又能刺激淋巴細胞增殖。酪蛋白水解物通過增強ConA誘導的IL-2以及IFN-γ產生來增強Th1免疫應答，但對IL-4和IL-10產生沒有影響。為此，本研究通過給C57BL/6小鼠喂食不同含量的酪蛋白飲食后，感染伯氏瘧

9、原蟲(Plasmodiumberghei ANKA，PbA)建立ECM模型，明確酪蛋白飲食對瘧疾感染過程和結局的影響。揭示酪蛋白防止ECM發(fā)生的相關機制，并為流行區(qū)腦瘧兒童免疫干預策略的確立提供新的理論依據(jù)。
　　 實驗方法:
　　 1、實驗動物及模型構建
　　 3-4周齡，雌性C57BL/6小鼠經腹腔感染感染1×106 Pb ANKA寄生紅細胞，感染前給予不同酪蛋白飲食飼養(yǎng)一個月。監(jiān)測小鼠體重和感染率。

10、　　 2、小鼠血腦屏障通透性檢測
　　 1)將各組小鼠靜脈注射200μl2％伊文思藍染料。
　　 2)1h后，心臟灌注生理鹽水而至流出清亮液體為準，然后取腦，拍照。
　　 3)將各組小鼠的腦放入離心管中，管內加入1ml甲酰胺，37℃孵育48h。
　　 4)將各管取出，3000rpm離心15min，取上清液200μl，放于96孔板中。
　　 5)630nm檢測OD值。
　　 3、免疫組化<

11、br>　　 腦組織切片標本經4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶連結法（即S-p法）進行免疫細胞化學染色:①切片常規(guī)烤片，脫蠟，水化;②0.01mol/L檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復3min;③內源性過氧化物酶阻斷溶液37℃下孵育15min;④非免疫性動物血清37℃下孵育15min;⑤一抗4℃下孵育過夜，VCAM-1抗體稀釋比例均為1∶150;⑥生物素標記的二抗37℃下孵育30min;⑦

12、鏈霉素親和素過氧化物酶溶液37℃下孵育30min;⑧新配置的DAB顯色液顯色5min;⑨蘇木素復染，中性樹膠封片。各步之間用PBS(PH=7.4)沖洗三次，每次5min。以PBS代替一抗做陰性對照。
　　 4、 Real-time RT-PCR
　　 腦組織Total RNA的提取及反轉錄:按照說明書Trizol提取腦組織RNA，然后使用分光光度計測定濃度。用PrimeScriptTM RT試劑盒（Takara公司）去除

13、基因組DNA，將RNA反轉錄成cDNA。反轉錄體系為10μl，含有PrimeScriptTM緩沖液，PrimeScriptTM RT酶混合物，oligo dT引物(50μM)和隨機引物兩種(100μM)及500ng總RNA。Real-time反應:用得到的cDNA作為模板和特定引物進行PCR反應。使用SYBR(R) Premix Ex TaqTM試劑盒在ABI7500(ABI，USA)機器上進行定量PCR(Takara公司)。反應條件如

14、下:95℃預變性30秒，40個PCR循環(huán)（95℃5秒和60℃30秒）。采用2-△△CT法量化各蛋白飲食組之間的相對基因表達。
　　 5、流式細胞術
　　 脾臟流式細胞術:
　　 無菌取出感染前（第0d）和感染后第3d、5d小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細胞懸液，用0.17 mol/LNH4Cl裂解紅細胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調整脾細胞終濃度為1×107/ml。每份樣品用抗-CD11 c-FIT

15、C單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體、抗-CD45R/B220-PerCP和抗-MHCⅡ-APC單克隆抗體進行四色分析，另設陰性對照管。在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，每份樣品用抗-CD11 c-FITC單克隆抗體和/或抗TLR4-PE單克隆抗體進行雙色分析，另設陰性對照管，離心去上清后，每管加入固定透膜劑250μl，1h后，洗滌細胞，加入生物素-TLR-9抗體，4℃染色30 mi

16、n，然后洗滌細胞，再加入親和素-PE，4℃染色30 min，洗滌細胞之后每管加入0.3ml細胞染色緩沖液。在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入脾細胞懸液0.1ml，刺激5h后，再加入抗-CD4-FITC單克隆抗體，固定透膜后加入抗T-bet-PerCP和IFN-γ-PE單克隆抗體，染色30min。離心去上清后，用0.3ml細胞染色緩沖液重懸浮細胞。每管加入脾細胞懸液0.1m，然后除對照管外，每管加入CM-H2DCF

17、DA（終濃度為5μM），37℃孵育30min，取出之后，用PBS洗滌，然后加入抗-F4/80-PerCP單克隆抗體和抗-CD11b-PE抗體進行染色，之后洗滌細胞加入0.3ml細胞染色緩沖液。每份樣品用抗CD4-FITC和抗CD25-PE單抗進行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC單抗進行胞內染色，用含1％ FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于0.5 ml PBS中，流式細胞儀進行檢測。
　　 腦組織流式細胞術:
　　

18、 將小鼠處死，取出腦，用150目篩網研磨腦。然后加入到5ml含有100U/mlⅣ型膠原酶的RPMI1640中，42℃水浴45min。300g離心10min，收集細胞沉淀，用30％ Percoll重懸沉淀，然后加入到70％ Percoll上層（用PBS配制），515×g室溫離心30 min。收集中間層，加入10 ml PBS300×g離心10 min，然后標記相應的抗體:FITC-CD4、PE-CD11b、PerCP-CD8和APC-Gr

19、-1。4℃染色30 min，PBS洗滌細胞兩次，上機檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析。
　　 6、ELISA
　　 用ELISA試劑盒分別檢測血清或脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α及IL-10的分泌水平。酶標儀測定450nm處OD值。實驗操作按照試劑盒說明書進行，結果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，應用SoftMax Pro4.3.1Ls軟件分析，計算細胞因子含量(pg/ml)。
　　 7、統(tǒng)計學分析
　

20、　 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，標本采用獨立樣本t檢驗和one wayANOVA比較分析組內和組間均值差異。采用Kaplan-Meyer方法進行生存期分析。P＜0.05為顯著差異。
　　 實驗結果:
　　 1、不同含量酪蛋白飲食對ECM小鼠的感染率和生存期的影響
　　 感染Pb ANKA的NC組小鼠于d3，在外周血中可見瘧原蟲感染的紅細胞(infectedred blood cells，iRBC

21、s)，隨后紅細胞感染率緩慢上升并維持在較低水平(＜10％)，于d5-9全部死于CM。5％酪蛋白飲食組小鼠在d9之前的原蟲血癥水平變化與NC組小鼠相似，但小鼠全部存活，之后，原蟲血癥水平逐漸升高，在感染后d23達到峰值(～50％)，d24～25死于貧血。20％和35％酪蛋白飲食組在感染后d7才可鏡檢到iRBCs，兩組紅細胞感染率顯著低于Pb ANKA感染小鼠(NC組)，隨后紅細胞感染率一直處于較低水平(＜2％)，于感染后d14紅細胞感染率

22、降至為0，小鼠自愈。
　　 2、不同含量蛋白飲食對體重及ECM臨床評分影響
　　 感染前1個月給予蛋白飲食會增加小鼠體重。各組小鼠體重在感染Pb ANKA后d1-d3體重下降，隨后NC組、20％和35％酪蛋白飲食組小鼠體重回升，而5％酪蛋白飲食組小鼠體重持續(xù)下降（與其它各組相比，P＜0.05）。感染Pb ANKA會引起給予維持飼料的C57BL/6小鼠(NC組)在d5-9天發(fā)生CM而死亡，與之相比，給予三種濃度的酪蛋白飲食

23、會明顯降低CM發(fā)生期間的臨床評分（與NC組相比，P＜0.05），同時低蛋白飲食(5％酪蛋白組)組小鼠的皮毛微微豎起，提示低蛋白飲食會影響小鼠的生理功能。
　　 3、不同含量酪蛋白飲食改善ECM血腦屏障的通透性
　　 腦瘧發(fā)生時腦組織血管的通透性明顯升高（與正常鼠相比，P＜0.01）。與NC組相比，給予不同含量酪蛋白飲食后能明顯抑制ECM引起的通透性升高(P＜0.01)。
　　 4、不同含量酪蛋白飲食對ECM血清前

24、炎癥細胞因子的影響
　　 感染后d3和d5，與ECM發(fā)生密切相關的IFN-γ水平在給予不同含量的酪蛋白飲食后均顯著低于NC組(P＜0.05);同時，各酪蛋白飲食組TNF-α水平在感染后d5也呈現(xiàn)相似的下降趨勢(P＜0.05)。
　　 5、不同含量酪蛋白飲食對腦組織CD4+、CD8+T細胞和中性粒細胞的影響
　　 在感染后d5，給予酪蛋白飲食能明顯降低腦組織中CD4+、CD8+T細胞和中性粒細胞的數(shù)量，提示不同含量

25、酪蛋白飲食能降低腦組織中與腦瘧過度前炎癥免疫應答密切相關CD4+、CD8+T細胞和中性粒細胞的數(shù)量來預防ECM的發(fā)生。
　　 6、不同含量酪蛋白飲食對腦組織ECM發(fā)生相關因子表達水平的影響
　　 我們通過Real-time RT-PCR方法檢測了腦組織中與ECM發(fā)生密切相關因子的mRNA表達水平。結果顯示不同含量酪蛋白飲食均能抑制Pb ANKA感染后d5的前炎癥因子IFN-γ、TNF-α和MMP9 mRNA水平，粘附分子

26、ICAM-1和趨化因子CXCL9、CXCL10的基因表達水平也得到顯著抑制（與正常感染相比，P＜0.05），而酪蛋白飲食組小鼠腦組織的抑炎性細胞因子IL-10水平在感染后d3顯著高于NC組(P＜0.05)，TGF-β mRNA水平并未受到明顯影響。由此提示給予不同含量酪蛋白飲食能夠抑制ECM模型腦組織中的前炎癥細胞因子、趨化因子和粘附分子的表達水平。
　　 7、不同含量酪蛋白飲食對ECM腦部微血管粘附分子VCAM-1的影響

27、>　　 給予酪蛋白飲食能明顯降低腦組織微血管VCAM-1的表達水平，降低VCAM-1表達陽性血管的數(shù)量及mRNA表達水平，提示不同含量酪蛋白飲食能通過降低腦組織VCAM-1的表達水平來預防ECM的發(fā)生。
　　 8、酪蛋白飲食對ECM模型中Th1細胞及其相關細胞因子的影響
　　 在感染后d3，給予20％和35％酪蛋白飲食能明顯增強Th1細胞數(shù)量及IFN-γ的分泌水平（與NC組相比，P＜0.05）;在感染后d5，Th1細胞

28、數(shù)量及TNF-α的分泌水平顯著降低(與NC組相比，P＜0.05)。
　　 9、不同含量酪蛋白飲食對ECM模型DC亞群及其功能分子的影響
　　 在感染后d3，給予不同含量酪蛋白飲食不影響CD11c+DCs、mDCs和pDCs數(shù)量（與NC組相比，P＞0.05），同時TLR4和MHCⅡ分子表達水平也沒有受到明顯影響，但給予20％酪蛋白顯著增強CD11c+ TLR9+ DCs細胞數(shù)量。在感染后d5酪蛋白飲食組mDCs的數(shù)量顯著低

29、于NC組(P＜0.05)，pDC和表達MHCⅡ類分子的CD11c+DCs數(shù)量沒有明顯改變（與NC組相比，P＞0.05），但表達TLR4和TLR9的CD11c+DCs數(shù)量明顯降低（與NC組相比，P＜0.05）。
　　 10、酪蛋白飲食對ECM模型中巨噬細胞的影響
　　 在感染后d3，酪蛋白飲食組的CD11b+F4/80+巨噬細胞數(shù)量高于NC組(P＜0.05)，同時，酪蛋白飲食組中脾細胞培養(yǎng)上清中的NO分泌水平也顯著高于NC

30、組(P＜0.05)，但同時CD11b+F4/80+巨噬細胞的ROS水平卻低于NC組。在感染后d5，酪蛋白飲食組與NC組之間的CD11b+F4/80+巨噬細胞數(shù)量沒有顯著差別，但20％酪蛋白飲食組的ROS水平高于NC組(P＜0.05)。
　　 11、酪蛋白飲食對ECM模型中Treg及IL-10的影響
　　 在感染后d3，酪蛋白飲食不影響Treg數(shù)量，20％和35％酪蛋白飲食組脾細胞培養(yǎng)上清中的IL-10水平顯著高于NC組(

31、P＜0.05)。在感染后d5，酪蛋白飲食會降低脾臟中Treg的數(shù)量及IL-10的mRNA水平，但培養(yǎng)上清中IL-10水平沒有明顯變化。
　　 結論:
　　 1.不同含量(5～35％)的酪蛋白飲食有助于維持血腦屏障的完整，預防ECM的發(fā)生。
　　 2.5％酪蛋白（低濃度酪蛋白）飲食雖能預防ECM發(fā)生，但會降低小鼠體重，影響小鼠生理功能，使其無法抵抗瘧原蟲感染引起的重癥貧血。
　　 3.不同含量的酪蛋白飲食會

32、顯著降低ECM小鼠血清和腦組織中IFN-γ和TNF-α等前炎癥細胞因子表達水平，抑制腦組織過度的炎癥應答，從而預防ECM的發(fā)生。
　　 4.不同含量的酪蛋白飲食能明顯降低ECM小鼠腦組織中的CD4+、CD8+T細胞和中性粒細胞的數(shù)量，進一步減少前炎癥細胞因子的分泌，減輕血管炎癥反應，預防ECM的發(fā)生。
　　 5.不同含量的酪蛋白飲食能顯著降低腦組織與ECM發(fā)生密切相關的粘附分子和趨化因子的表達水平，防止血腦屏障的破壞，從