課題一：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對實驗性結(jié)腸炎的治療作用及機(jī)制探討;課題二：胰腺類癌的臨床病理特點分析.pdf

1、研究背景:
　　 炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是慢性反復(fù)發(fā)作的非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)。近年，IBD在我國的發(fā)病率明顯增加，已成為消化系統(tǒng)常見疾病和慢性腹瀉的主要病因，多數(shù)患者病情呈長期反復(fù)發(fā)作，往往發(fā)展為終身致殘性的慢性疾病，且患者多為青壯年，嚴(yán)重影響個人生活質(zhì)量甚至危及

2、患者生命。迄今，治療上尚缺乏特異有效的藥物，并且可能引起比較嚴(yán)重的毒副作用。因此，迫切需要探索新的有效的治療手段。
　　 目前普遍認(rèn)為IBD是由于腸黏膜免疫系統(tǒng)對腸道共柄菌群和其它腸腔內(nèi)抗原的不恰當(dāng)應(yīng)答而引起的不可控的腸道炎癥。另外，腸上皮屏障損傷亦在IBD的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能，在一定的條件下，能向中胚層、外胚層和

3、內(nèi)胚層組織細(xì)胞分化，從而參與損傷組織的修復(fù)。最近的研究表明MSCs免疫原性低，能逃避免疫識別，并具有免疫抑制功能，對抗原提呈細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞均有調(diào)節(jié)作用。目前MSCs已用于臨床治療成骨發(fā)育不全和嚴(yán)重的移植物抗宿主病(graft versushost disease，GVHD)。MSCs對免疫相關(guān)疾病有潛在的治療作用，然而，是否可應(yīng)用于IBD的治療，目前尚不清楚。鑒于此，我們擬通過建立IBD動物模型，在此基礎(chǔ)上觀察

4、外源性輸注骨髓MSCs對IBD動物的治療效果，并探討其可能的機(jī)制。
　　 第一部分實驗性結(jié)腸炎動物模型的建立
　　 [目的]:
　　 雖然IBD動物模型不能反應(yīng)人類相應(yīng)疾病的復(fù)雜性，但仍然是目前IBD研究的重要工具。由葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulphate sodium，DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎動物模型被人們廣泛應(yīng)用，然而，不同鼠株的遺傳差異和DSS分子量大小是影響DSS結(jié)腸炎病變特征的重要因素。該部分研究旨

5、在建立穩(wěn)定的可重現(xiàn)性的DSS急性結(jié)腸炎小鼠模型。
　　 [方法]:
　　 以5％ DSS(分子量36000-50000)水溶液喂養(yǎng)7周齡雌性Balb/c(H-2d)小鼠，對照組動物正常自由飲水。每天定時對動物體重、大便粘稠度、大便隱血或肉眼血便等進(jìn)行臨床評估，實驗第8天，取全結(jié)腸和小腸進(jìn)行組織病理學(xué)評價。
　　 [結(jié)果]:
　　 由濃度5％、分子量36000-50000的DSS誘導(dǎo)建立的Balb/c小鼠結(jié)

6、腸炎，以結(jié)腸遠(yuǎn)端病變最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為血性腹瀉、結(jié)腸潰瘍、組織粒細(xì)胞浸潤。這些特征類似于人類UC。
　　 第二部分小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及體外擴(kuò)增
　　 [目的]:
　　 利用骨髓MSCs在塑料組織培養(yǎng)器皿上能貼壁生長的特性，分離小鼠骨髓MSCs，并進(jìn)行培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增。
　　 [方法]:
　　 取3周齡雄性Balb/c小鼠股骨和脛骨的骨髓細(xì)胞，按106/cm2的細(xì)胞密度接種于組織培養(yǎng)瓶，培

7、養(yǎng)基為專用的小鼠MSCs完全培養(yǎng)基(Stem Cell公司)。48h后首次換液，之后，每3-4天更換完全培養(yǎng)基一次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％以上融合時(約1-2周)，0.25％胰酶370C消化5min傳代。取第2代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化實驗。
　　 [結(jié)果]:
　　 全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)，在反復(fù)換液去除非貼壁細(xì)胞后，細(xì)胞集落逐漸呈現(xiàn)為梭形成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。連續(xù)傳代2-3代以后，獲得形態(tài)比較均一的平行排列或旋渦樣單層梭形細(xì)胞集落。誘導(dǎo)分化

8、實驗顯示我們體外擴(kuò)增的MSCs具有成骨分化能力。
　　 第三部分骨髓MSCs對實驗性結(jié)腸炎的治療研究
　　 [目的]:
　　 研究經(jīng)外周靜脈外源性給予骨髓MSCs對小鼠DSS結(jié)腸炎的治療作用，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 [方法]:
　　 在誘導(dǎo)成功的DSS結(jié)腸炎小鼠，經(jīng)尾靜脈注射0.3ml含1×106 MSCs細(xì)胞的PBS細(xì)胞懸液，對照組則經(jīng)尾靜脈注射PBS。為觀察MSCs在DSS結(jié)腸炎小鼠腸

9、道的遷移定殖情況，部分小鼠(n=3)注射CM-Dil標(biāo)記的MSCs。每天定時對動物進(jìn)行臨床評估，實驗第15天，取小鼠結(jié)腸進(jìn)行組織病理學(xué)評價。實時熒光相對定量RT-PCR檢測結(jié)腸組織中促炎介質(zhì)(TNF-α，IL-1β)的表達(dá)水平。ELISA測定外周血漿中TNF-α的水平。
　　 [結(jié)果]:
　　 1.外源性輸注骨髓MSCs后，DSS結(jié)腸炎小鼠的臨床癥狀、組織病理學(xué)改變均明顯改善。
　　 2.在MSCs治療組小鼠，結(jié)

10、腸遠(yuǎn)端炎癥病變組織中促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)較對照組下調(diào)，外周血漿中TNF-α水平亦較對照組下降。
　　 3.CM-Dil標(biāo)記的MSCs聚集于結(jié)腸炎癥病變部位，主要位于黏膜下層。同一小鼠結(jié)腸近端及小腸組織內(nèi)未見CM-Dil標(biāo)記的細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.經(jīng)外周靜脈輸注骨髓MSCs對小鼠DSS急性結(jié)腸炎有治療作用。
　　 2.骨髓MSCs可能通過下調(diào)促炎性細(xì)胞因子等抗炎作用而改

11、善DSS結(jié)腸炎。定殖于腸道病變部位的MSCs是否向腸上皮等腸道組織細(xì)胞分化以及分化的機(jī)制、與腸黏膜組織損傷修復(fù)的關(guān)系等，還有待更多、更深入的實驗來闡明。
　　 3.我們的實驗提示骨髓MSCs用于治療IBD的可行性，這對于臨床IBD的生物治療具有潛在的應(yīng)用前景。
　　 背景:
　　 胰腺類癌極其罕見，具有惡性生長潛能，預(yù)后較差。識別這類腫瘤對其治療和預(yù)后具有重大意義。本文目的是探討胰腺類癌的臨床病理特點。
　

12、　 方法:
　　 對中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1997年1月至2007年12月期間經(jīng)病理證實的8例胰腺類癌患者的臨床資料(癥狀/體征、伴發(fā)其他腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移、血清腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)特征、病理免疫組織化學(xué)染色、誤診率、手術(shù)治療情況等)進(jìn)行回顧性分析，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析胰腺類癌的臨床病理特點。
　　 結(jié)果:
　　 8例患者中，均未出現(xiàn)類癌綜合征，7例(87.5％)癥狀表現(xiàn)為非特異性的腹痛。2例伴發(fā)其他腫瘤，4例(50％)

13、患者腫瘤侵犯毗鄰臟器或發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CA199、CA125、CA72-4在胰腺類癌患者中的陽性率(高于正常值)分別為0％、25％、12.5％、0％。病理免疫組織化學(xué)染色檢查顯示Syn、CgA、NSE、CK陽性率分別為37.5％、62.5％、75％、75％。在手術(shù)和組織病理學(xué)檢查前，7例(87.5％)被誤診。5例患者(62.5％)接受腫瘤切除；另3例無法切除，僅行剖腹探查及活檢術(shù)。術(shù)后2例患者(25％)于住院期間死亡。