人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)在全球呈高發(fā)生率、高致殘率、高耗費(fèi)、發(fā)病年輕化等特點(diǎn)。脊髓損傷后由于廣泛的神經(jīng)元死亡、大量的軸突變性、彌漫性的脫髓鞘造成患者勞動(dòng)能力喪失、生活不能自理以及各種并發(fā)癥,其后果是終身性和毀滅性的,不僅給病人造成極大的痛苦,也給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。一個(gè)多世紀(jì)以來(lái),醫(yī)學(xué)界先后采用了手術(shù)、藥物、物理、基因以及細(xì)胞治療等多種方法來(lái)治療脊髓損傷,但都不能有效地解決患者不同程度的癱瘓這一難題

2、。因此,尋找有效而安全的脊髓損傷后的治療方法仍然是困擾醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題且具有非常重要的科學(xué)意義、經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)意義。外源性干細(xì)胞移植是近十幾年來(lái)脊髓損傷治療的研究熱點(diǎn),近些年來(lái)在胎兒附屬物如臍帶中發(fā)現(xiàn)有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞,具有低免疫原性、高增殖能力以及來(lái)源更方便等獨(dú)特的優(yōu)越性,體外研究顯示能夠向骨、軟骨、心肌、血管內(nèi)皮以及神經(jīng)系細(xì)胞等方向分化。因此,本研究利用人源性臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷,探討其療效和機(jī)制。
　　

3、第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 目的:
　　 探討人源性臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法并研究其生物學(xué)特性。
　　 方法:
　　 1.獲取健康、足月、剖腹產(chǎn)胎兒臍帶,剝離臍帶wharton's jelly膠,充分剪碎,組織塊貼壁培養(yǎng)法獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,體外傳代、純化、擴(kuò)增,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD73、CD90、CD105、CD14、

4、CD34、CD45、HLA-DR。
　　 結(jié)果:
　　 1.人臍帶wharton's jelly膠組織塊培養(yǎng)5-7 d后組織塊周圍即可見新生細(xì)胞,為長(zhǎng)梭形或多角形,培養(yǎng)至16-20 d細(xì)胞明顯增多,達(dá)90％以上融合,類似成纖維樣細(xì)胞,放射狀或漩渦狀分布。傳代后細(xì)胞增殖迅速,生長(zhǎng)3-4d細(xì)胞即呈80％-90％以上融合。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)CD73、CD90、CD105,不表達(dá)CD14、

5、CD34、CD45、HLA-DR。
　　 結(jié)論:
　　 1.應(yīng)用組織塊貼壁培養(yǎng)法能夠從臍帶wharton's jelly膠中培養(yǎng)出大量增殖能力較強(qiáng)的成纖維樣細(xì)胞。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓、臍血、胎盤等其它組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似的表面標(biāo)志。
　　 3.臍帶能為間充質(zhì)干細(xì)胞移植提供充足的干細(xì)胞來(lái)源。
　　 第二部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞磁標(biāo)記后生物學(xué)特性及磁共振信號(hào)

6、研究
　　 目的:
　　 探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)納米顆粒標(biāo)記及磁共振示蹤的可行性。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞的SPIO標(biāo)記共分為5個(gè)濃度組,分別為對(duì)照(0μg)、5.6μg、11.2μg、22.4μg和44.8μg Fe/ml,其中每個(gè)濃度有四個(gè)孵育條件,即12h-p11,24h-p11,12h+p11和24h+p11

7、。
　　 2.普魯士藍(lán)染色計(jì)數(shù)SPIO標(biāo)記細(xì)胞,計(jì)算標(biāo)記陽(yáng)性率,MTT法檢測(cè)SPIO標(biāo)記細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖活性。
　　 3.體外磁共振GRE T2*WI和SE T2WI成像檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞的磁共振信號(hào)。
　　 4.標(biāo)記細(xì)胞大鼠脊髓內(nèi)移植后,磁共振TSE T2WI成像追蹤體內(nèi)移植磁標(biāo)記細(xì)胞。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性率隨著孵育濃度和時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,在22.4μg Fe/ml濃度、24h-p11

8、條件下,細(xì)胞的標(biāo)記率達(dá)到94.1％,提高濃度到44.8μg Fe/ml、24h-p11,陽(yáng)性率不再升高;在5.6μg、11.2μg、22.4μg Fe/ml三個(gè)濃度下(孵育12h),增加p11可以顯著提高標(biāo)記率;在24h+p11條件下,細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯影響,大部分細(xì)胞壞死脫落。
　　 2.低于22.4μgFe/ml濃度標(biāo)記,細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖活性不受到明顯影響,濃度達(dá)到44.8μgFe/ml(孵育24h),二者均顯著減弱。
　

9、　 3.22.4μg Fe/ml SPIO標(biāo)記24h后,體外磁共振檢查示GRE T2*WI和SE T2WI上均呈低信號(hào),且隨著細(xì)胞數(shù)目的增加,信號(hào)不斷降低,與未標(biāo)記細(xì)胞組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)目呈直線相關(guān)。
　　 4.細(xì)胞移植3d后MRI檢查發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞注射點(diǎn)呈明顯的低信號(hào),而未標(biāo)記細(xì)胞注射點(diǎn)信號(hào)稍有減低。14d后標(biāo)記細(xì)胞注射點(diǎn)仍然可以追蹤到標(biāo)記細(xì)胞低信號(hào)。脊髓標(biāo)本普魯士藍(lán)和核固紅染色,可見標(biāo)記細(xì)胞注射點(diǎn)有大量SP

10、IO陽(yáng)性細(xì)胞,而未標(biāo)記細(xì)胞注射點(diǎn)則見到少量陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 結(jié)論:
　　 1.超順磁性氧化鐵納米顆粒能夠有效標(biāo)記人源性臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,且不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖活性。
　　 2.磁標(biāo)記細(xì)胞體外磁共振GRE T2*WI和SE T2WI成像可以產(chǎn)生特征性低信號(hào)轉(zhuǎn)變,其信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量成直線相關(guān)。
　　 3.磁共振TSE T2WI成像可以追蹤體內(nèi)移植磁標(biāo)記細(xì)胞,持續(xù)時(shí)間達(dá)2w以上。
　　 第三部分人臍

11、帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷療效及機(jī)制研究
　　 目的:
　　 研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的療效并初步探討其機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.36只SD健康成年雌性大鼠隨機(jī)分為:假手術(shù)組12只,大鼠只行T9-T11椎板切開術(shù),不行脊髓打擊傷;對(duì)照組12只,行T10段脊髓打擊傷,傷后第1d脊髓內(nèi)注射DMEM/F12;實(shí)驗(yàn)組,行T10段脊髓打擊傷,傷后第1d脊髓內(nèi)注射第5代人源性臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

12、
　　 2.于傷后1d、1w、3w、5w、7w、8w進(jìn)行行為學(xué)BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分;細(xì)胞免疫熒光染色觀察GDNF、BDNF和NT-3的表達(dá);于傷后3w采用ELISA檢測(cè)大鼠脊髓標(biāo)本GDNF、BDNF和NT-3的含量。
　　 3.于傷后1m、2m采用免疫熒光染色觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在宿主脊髓內(nèi)的遷移和分化。
　　 4.于傷后2m采用免疫組織化學(xué)染色觀察GAP-43、NF-200、GFAP在脊髓內(nèi)的表達(dá)。
　　

13、 結(jié)果:
　　 1.假手術(shù)組運(yùn)動(dòng)功能于1w后基本正常,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組隨著時(shí)間的延長(zhǎng),運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù),在傷后3w內(nèi)恢復(fù)明顯。第5w后實(shí)驗(yàn)組的BBB評(píng)分與對(duì)照組相比明顯升高。
　　 2.細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示BDNF、nestin無(wú)表達(dá),GDNF、NT-3弱表達(dá)。ELISA檢測(cè)可見實(shí)驗(yàn)組GDNF、NT-3含量比對(duì)照組明顯增多,而BDNF兩組間無(wú)明顯差別。
　　 3.移植后2m,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在宿主脊髓內(nèi)存活并

14、且呈縱向遷移,距離達(dá)到5mm,損傷區(qū)可見大量hNu染色陽(yáng)性細(xì)胞匯集。移植后第1m、2m未見到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。
　　 4.移植后2m,GFAP免疫組化染色結(jié)果顯示對(duì)照組脊髓損傷區(qū)周圍灰質(zhì)和白質(zhì)GFAP表達(dá)明顯比實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組增強(qiáng),對(duì)照組脊髓損傷程度比實(shí)驗(yàn)組重,GFAP形成致密的膠質(zhì)瘢痕;NF-200免疫組化染色結(jié)果顯示對(duì)照組脊髓損傷區(qū)周圍NF-200陽(yáng)性神經(jīng)纖維長(zhǎng)度明顯比實(shí)驗(yàn)組縮短:

15、GAP-43免疫組化染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組脊髓損傷區(qū)周圍GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞比對(duì)照組明顯增多,并且有較多典型的再生軸突生長(zhǎng)錐樣結(jié)構(gòu),對(duì)照組未見到典型的生長(zhǎng)錐。
　　 結(jié)論:
　　 1.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植后能夠在宿主脊髓內(nèi)存活,并且沿著脊髓縱軸遷移。但是不能見到其向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。
　　 2.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植后能夠分泌GDNF和NT-3促進(jìn)大鼠脊髓損傷后后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分增加,從而改善行