肝臟為γδT細胞胸腺外發(fā)育場所的初步驗證.pdf

1、目的:肝臟不僅是重要的代謝器官，而且也是一個免疫器官。肝臟中富含天然免疫細胞，其獨特的免疫細胞組成對于其功能特點的形成具有重要作用。許多研究表明，成年個體肝臟中含有造血干細胞，將其轉(zhuǎn)輸回體內(nèi)后能發(fā)育為各類免疫細胞，并且能長期維持。因此，成年肝臟也被認為具有造血功能的器官，尤其是在骨髓造血功能受到破壞或抑制時，其可能成為機體代償性造血的髓外造血器官。但該作用和機制尚需深入的研究和證實。肝臟獨特的造血功能是否會影響肝臟微環(huán)境中免疫細胞的組成

2、和發(fā)育分化，該領(lǐng)域尚少有人涉足。
　　肝臟免疫系統(tǒng)的特點之一是富含NKT、NK與γδT細胞等天然免疫細胞。近年來的研究表明，肝臟中存在一群肝臟駐留的NK細胞，與經(jīng)典的NK細胞在表型、分布、功能與發(fā)育等方面存在巨大差異，認為其可能由肝臟造血細胞發(fā)育而來。許多研究也表明，γδT細胞存在胸腺外發(fā)育途徑，小腸是其發(fā)育場所之一。鑒于γδT細胞在肝臟淋巴細胞中所占比例明顯高于脾臟、淋巴結(jié)及外周血，那么，肝臟是否也可能是γδT細胞胸腺外發(fā)育場所

3、，從而進一步影響肝臟γδT細胞的組成？為了探討這些問題，本課題在確定肝臟相對于其他免疫器官富含γδT細胞的基礎(chǔ)上，從四個方面進行了研究。首先，檢測比較了肝臟中CD4CD8雙陰性T前體細胞(DN1-DN4)的含量，觀察肝臟中T前體細胞含量變化的時間動力學(xué)變化。發(fā)現(xiàn)肝臟的確存在T前體細胞，且以DN1和DN2細胞居多。其次，通過體外培養(yǎng)和過繼轉(zhuǎn)輸實驗，在功能上驗證肝臟中T前體細胞是否具有向γδT細胞發(fā)育的潛能。再次，檢測了肝臟中是否含有向γδ

4、T細胞定向分化的γδT前體細胞，進一步觀察其是否具有不同于胸腺γδT前體細胞的表型和功能特點。最后，通過γδT細胞亞群的分布、細胞表型以及在鼠傷寒桿菌感染時應(yīng)答特點，初步研究了肝臟γδT細胞的表型和功能特點。
　　方法:
　　1、分離提取肝臟、小腸、、皮膚、胸腺、脾臟與淋巴結(jié)內(nèi)的單個核細胞，通過流式細胞術(shù)檢測其中γδT細胞的比例。
　　2、通過PMA與離子霉素體外刺激，流式細胞術(shù)檢測小鼠肝臟、胸腺與脾臟中γδT17與γ

5、δT1細胞亞群組成的時間動力學(xué)變化曲線。
　　3、通過流式細胞術(shù)檢測各組織中T前體細胞的含量及肝臟中DN1-DN2的時相變化。
　　4、通過流式細胞術(shù)檢測肝臟中γδT前體細胞的表型、轉(zhuǎn)錄因子的表達與細胞因子的分泌。
　　5、通過OP9-DL1誘導(dǎo)培養(yǎng)與過繼轉(zhuǎn)輸實驗，觀察肝臟或胸腺來源的T前體細胞向γδT細胞發(fā)育的能力。
　　6、通過灌胃感染建立鼠傷寒沙門氏菌感染模型，流式細胞術(shù)檢測肝臟γδ T細胞的活化與細胞因子

6、的分泌情況。
　　結(jié)果:
　　1、肝臟γδT細胞的比例顯著高于胸腺、脾臟與淋巴結(jié)。γδT17細胞的比例在胸腺中隨著周齡的增加逐漸下降，在脾臟與肝臟中則逐漸升高。胸腺與肝臟中γδT1細胞的比例與周齡無明顯聯(lián)系，脾臟中隨著周齡的增加逐漸下降。
　　2、與野生小鼠相比，無胸腺裸鼠肝臟中γδT細胞雖然比例明顯下降，但仍存在一定數(shù)量的γδT細胞，且具有分泌細胞因子的能力;而脾臟中γδT細胞幾乎不存在。
　　3、無胸腺裸鼠與

7、野生小鼠肝臟中存在大量T前體細胞DN1與DN2細胞。DN2細胞從小鼠出生后第2周開始在肝臟中逐漸出現(xiàn)，在第4周時其比例達到最高峰。與胸腺DN2細胞相比，肝臟DN2細胞高表達CD117、低表達CD90與CD25。
　　4、成年小鼠肝臟中存在CD24hiCD73+γδT前體細胞，其比例隨著周齡增加逐漸升高。成年小鼠肝臟CD24hiCD73+γδT前體細胞具有較強地分泌細胞因子的能力，高表達CD44、轉(zhuǎn)錄因子T-bet與RORγt，低表

8、達CD27。
　　5、通過與OP9-DL1細胞共孵育，肝臟來源的DN1細胞可以發(fā)育為γδT細胞，且比例較胸腺來源的DN1或DN2細胞高。體內(nèi)過繼轉(zhuǎn)輸實驗顯示，肝臟來源的DN2細胞可以發(fā)育為γδT前體細胞與成熟γδT細胞。
　　6、肝臟中γδT細胞的表型特點是低表達CD27、高表達CD44。成年小鼠肝臟γδT細胞主要為γδT17細胞，小腸γδT細胞以γδT1細胞占優(yōu)勢，脾臟或胸腺中無亞群特異性分布。
　　7、在鼠傷寒沙門

9、氏菌感染第3天時，肝臟中γδT細胞分泌IL-17a的比例已明顯升高。在感染第5天時，肝臟中γδT細胞CD69表達明顯升高，且分泌IFN-γ的比例也明顯升高。
　　結(jié)論:
　　1、除小腸與皮膚外，肝臟含有相對豐富的γδT細胞。
　　2、肝臟中存在γδT前體細胞，且具有獨特表型和功能特點。
　　3、肝臟T前體細胞DN1或DN2細胞具有向γδT細胞發(fā)育的能力。肝臟可能為γδT細胞胸腺外發(fā)育分化的場所。
　　4、肝