CD226在小鼠胸腺細(xì)胞發(fā)育中的作用研究.pdf

1、胸腺是機(jī)體的中樞免疫器官，也是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。關(guān)于胸腺細(xì)胞的發(fā)育是當(dāng)前發(fā)育生物學(xué)和免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)問題之一。在胸腺的發(fā)育過程中，來源于胚胎肝臟和骨髓的淋巴樣干細(xì)胞進(jìn)入胸腺后，在胸腺微環(huán)境中，經(jīng)過復(fù)雜的分化和發(fā)育過程，最終只有不到5％的胸腺細(xì)胞能成為具有功能的CD4或CD8單陽性（SP）T細(xì)胞，輸出胸腺，定位于外周淋巴器官和組織，成為成熟T細(xì)胞。在這個過程中，許多黏附分子發(fā)揮了重要作用。
　　CD226分子是一種黏附

2、分子，屬于免疫球蛋白超家族成員。人CD226分子在1996年克隆成功，主要表達(dá)于活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨核/血小板譜系、單核細(xì)胞以及活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與T細(xì)胞的分化和NK細(xì)胞的殺傷、血小板的活化與聚集等重要的生理過程。其在小鼠體內(nèi)的同源分子mCD226于1999年被發(fā)現(xiàn)。近期的研究表明，mCD226可以與其配體mCD112和mCD155/Tage4相作用，為抗原特異性的T細(xì)胞提供共刺激信號。此外，還有研究表明mCD226分子主要表達(dá)

3、于BALB/c小鼠脾臟和淋巴結(jié)來源的T細(xì)胞，并特異性地表達(dá)于分化的Th1細(xì)胞表面，向小鼠體內(nèi)注射CD226特異性抗體，可以有效延遲并減輕Th1細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎（EAE）的發(fā)生。胸腺是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的重要場所，因此研究mCD226在胸腺細(xì)胞上的表達(dá)并確定其在胸腺發(fā)育過程中的生理功能十分必要。
　　在本研究中，我們首先利用mCD226特異性多克隆抗體檢測了其在胸腺細(xì)胞上的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mCD226主要表達(dá)

4、于CD4和CD8單陽性胸腺細(xì)胞表面。在CD4CD8雙陽性（DP）細(xì)胞上，其主要表達(dá)于CD69+DP細(xì)胞表面；在CD69+SP和CD69-SP兩群細(xì)胞之間，mCD226的表達(dá)沒有明顯差異。這種表達(dá)模式說明DP細(xì)胞上的mCD226可以在陽性選擇的過程中被誘導(dǎo)表達(dá)，與mCD226特異性的高表達(dá)于經(jīng)過陽性選擇的SP胸腺細(xì)胞結(jié)果相一致。我們還發(fā)現(xiàn)mCD226在CD4和CD8單陽性胸腺細(xì)胞上有不同的表達(dá)模式，在CD4SP細(xì)胞上呈單峰表達(dá)，在CD8S

5、P細(xì)胞上呈雙峰表達(dá)。由于CD8SP細(xì)胞由成熟和未成熟細(xì)胞構(gòu)成，經(jīng)檢測我們發(fā)現(xiàn)mCD226主要表達(dá)于CD4-CD8+TCRhigh細(xì)胞上，在CD4-CD8+TCRlow細(xì)胞上幾乎不表達(dá)，這可能就是mCD226在CD4和CD8單陽性胸腺細(xì)胞上有不同表達(dá)模式的原因之一。此外，在對處于不同發(fā)育階段的小鼠胸腺細(xì)胞進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，CD4SP細(xì)胞上mCD226的表達(dá)在出生1天后迅速升高，但CD8SP細(xì)胞上mCD226的表達(dá)則在發(fā)育過程中逐漸升高，這些

6、結(jié)果表明mCD226在CD4SP細(xì)胞上呈組成型表達(dá)，但在CD8SP細(xì)胞上呈誘導(dǎo)性表達(dá)，兩者可能受到不同機(jī)制的調(diào)控，但這還需要進(jìn)一步的研究。
　　mCD226在胸腺細(xì)胞上特異性的表達(dá)模式，提示其可能對胸腺細(xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生影響。為了深入研究該分子的功能，我們通過軟件預(yù)測了三對mCD226的RNA干涉序列，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)其中之一對外源性表達(dá)的mCD226具有良好的干涉效果，將其插入pLKO.1慢病毒載體，用包裝出的高滴度病毒對EL-4細(xì)胞進(jìn)行

7、感染，發(fā)現(xiàn)其可以在mRNA和蛋白水平對天然mCD226的表達(dá)產(chǎn)生明顯的抑制作用，這為進(jìn)一步研究mCD226的功能提供了有力的研究工具。
　　在本研究中我們還成功建立了小鼠胚胎胸腺器官培養(yǎng)（FTOC）模型，在FTOC中加入mCD226RNAi慢病毒后，發(fā)現(xiàn)其可以有效降低胸腺細(xì)胞上mCD226的表達(dá)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，mCD226的表達(dá)降低會使胸腺細(xì)胞的數(shù)目減少，凋亡增加，提示mCD226可能在胸腺細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮重要的抗凋亡功能。我

8、們還發(fā)現(xiàn)在凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，去除培養(yǎng)基中的血清或加入Dex后，mCD226的抗凋亡作用仍然存在，說明這種抗凋亡作用是抗原非特異性的。mCD226的這種抗凋亡作用與凋亡相關(guān)分子survivin密切相關(guān)，F(xiàn)TOC中胸腺細(xì)胞上mCD226的表達(dá)降低會引起survivin表達(dá)的降低，所有這些結(jié)果與mCD226轉(zhuǎn)基因小鼠中的結(jié)果吻合，因此推測survivin可能在mCD226影響胸腺細(xì)胞凋亡發(fā)生的過程中發(fā)揮重要作用。
　　為了進(jìn)一步明確mCD

9、226與survivin的關(guān)系，我們以小鼠胸腺瘤細(xì)胞系EL-4為模型，發(fā)現(xiàn)提高其中mCD226的表達(dá)可以同時有效提高其中survivin的表達(dá)，導(dǎo)致EL-4細(xì)胞凋亡減少，且這種作用同樣發(fā)生在對survivin分子進(jìn)行RNA干涉后。這些結(jié)果從細(xì)胞水平上證實(shí)了mCD226對胸腺細(xì)胞的抗凋亡作用至少部分是通過上調(diào)survivin的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　mCD226的配體為mCD112和mCD155/Tage4，這兩種分子廣泛表達(dá)于胸腺細(xì)胞以

10、及胸腺基質(zhì)細(xì)胞表面。除此之外，CD226還與LFA-1密切相關(guān)，LFA-1作為一種重要的黏附分子，參與免疫突觸的形成，并在胸腺細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，mCD226與其配體或LFA-1的相互作用可能在mCD226抗胸腺細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。
　　胸腺發(fā)育是一個非常復(fù)雜但高度有序的過程，許多分子在這個過程中發(fā)揮不同的重要作用。本研究首次全面闡明了mCD226分子在胸腺細(xì)胞上的表達(dá)模式，并利用RNA干涉慢病毒在FTOC模型和EL