CARM1對胚胎造血以及胸腺細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié).pdf

1、造血干細(xì)胞的自我更新以及全能分化的能力持續(xù)終身[1]。表觀遺傳修飾能夠促進(jìn)細(xì)胞分化。因為細(xì)胞分化前后的遺傳信息不同，DNA甲基化和組蛋白甲基化等表觀修飾對于細(xì)胞分化保持在某一狀態(tài)必不可少[2]。表觀遺傳機制如同鉸鏈般控制定向分化，但是一般來說對去分化卻不起這樣的作用。一些小分子表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白，以及一些特殊基因的過表達(dá)，可以作為影響細(xì)胞分化的可塑性元件。當(dāng)這些因素被逆轉(zhuǎn)，會導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入iPS(induced pluripotent st

2、em)全能分化狀態(tài)[3]。由此，造血干細(xì)胞的分化過程可能是研究表觀遺傳改變的最好的生物學(xué)系統(tǒng)。近期研究對DNA的甲基化模式的研究表明在造血過程中每一個時期，每個亞群細(xì)胞定向中存在其特殊的甲基化形式[4]。同DNA甲基化一樣，大量相關(guān)研究表明精氨酸甲基化在淋巴細(xì)胞分化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中作用同樣重要[5]。
　　作為一種常見的轉(zhuǎn)錄后修飾，精氨酸的甲基化往往改變其底物的生物學(xué)作用[6]，其機理如下:1）為含Tudor結(jié)構(gòu)的效應(yīng)因子(effec

3、tot molecules)提供了錨docking site[7,8,9,10];2）阻斷蛋白-蛋白相互作用，如某些SH3結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的相互作用[11];3）對AKT介導(dǎo)的磷酸化的負(fù)調(diào)節(jié)作用，因為AKT序列含有氨基酸殘基[12,13];4）阻斷賴氨酸甲基化[14,15]。
　　在胞漿和胞核中都有蛋白質(zhì)精氨酸甲基化酶(arginine methyltransferases，PRMTs)的底物存在，組蛋白是胞核中的一種非常重要的底物。PR

4、MTs催化的組蛋白甲基化是轉(zhuǎn)變細(xì)胞命運的表觀遺傳密碼的主要成因。哺乳動物PRMT酶家族有九個成員，分別是PRMT1-9。大多數(shù)成員都作用于組蛋白H3的N端，組蛋白4(H4)，以及組蛋白2A(H2A)[16]。
　　CARM1/PRMT4是這個家族中第一個被發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄輔激活因子功能的成員，其作用于H4R17，H3R26，以及其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[6,17]。前期研究表明CARM1 Knockout小鼠胚胎比野生型小，出生后無法正常呼吸，

5、即刻死亡[18]。對于該動物模型的研究已經(jīng)表明若干表型的存在，大部分與細(xì)胞分化相關(guān)。CARM1 Knock out出生致死性與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞過多導(dǎo)致肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞發(fā)育不全有關(guān)。由此，CARM1在正常肺泡細(xì)胞分化中有重要作用[19]。CARM1 Knock out小鼠缺乏棕色脂肪，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CARM1 null細(xì)胞不能分化成脂細(xì)胞[20,21]。CARM1在軟骨發(fā)生以及骨骼肌發(fā)育中作用相當(dāng)重要[22]，對于維持正常胚胎T細(xì)胞數(shù)量及分

6、化有重要作用[23,24]。綜上，CARM1活性在多個器官包括肺，脂肪，肌肉，軟骨以及胸腺細(xì)胞中有不可或缺的作用。本課題將進(jìn)一步探索CARM1 Knock out小鼠模型的免疫系統(tǒng)表型，CARM1在胸腺細(xì)胞發(fā)育中的作用，及其產(chǎn)生的機制。
　　第一部分敲除CARM1基因?qū)π∈罅馨图?xì)胞發(fā)育的影響
　　目的:
　　觀察敲除CARM1基因?qū)π∈笮叵偌?xì)胞發(fā)育造成的影響。
　　方法:
　　通過同系繁殖CARM1+/-小

7、鼠，培育CARM1-/-胚胎;Southern Blot及PCR驗證小鼠基因型;通過細(xì)胞計數(shù)及流式細(xì)胞分析技術(shù)，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物不同，區(qū)分不同亞群，獲得各個亞群的信息，分析胸腺細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　　驗證小鼠體內(nèi)CARM1基因被成功敲除;CARM1基因敲除鼠身長顯著小于野生型，僅為對照的60％大小;CARM1基因敲除鼠的胸腺亦顯著小于對照;CARM1-/-胸腺細(xì)胞數(shù)顯著少于對照;CARM1-/-胸腺中，DN1細(xì)胞數(shù)量與對照

8、相近，但DN2，DN3，DN4均減少90％，CD4SP，CD8SP減少75％，γδT細(xì)胞數(shù)量顯著減少85％。
　　小結(jié):
　　驗證小鼠體內(nèi)CARM1基因確被敲除;驗證胚胎表型，包括胚胎長度為對照60％，胸腺發(fā)育不全，存在DN1-DN2發(fā)育阻滯。
　　第二部分 CARM1-/-小鼠胚胎中胸腺細(xì)胞發(fā)育缺陷與胸腺上皮細(xì)胞的關(guān)系
　　目的:
　　鑒于胸腺細(xì)胞發(fā)育與胸腺上皮細(xì)胞(TEC)聯(lián)系密切，探討CARM1-/-

9、小鼠胸腺發(fā)育不全是否有胸腺上皮細(xì)胞中缺乏CARM1引起。
　　方法:
　　培育CARM1-/-胚胎，免疫熒光化學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測E18.5胸腺上皮細(xì)胞各組分的分布;構(gòu)建腎包膜下同種異體胸腺移植模型，分別將去除胸腺細(xì)胞的胸腺上皮組織，植入先天性無胸腺卻有來自骨髓的正常胸腺前T細(xì)胞的受體裸鼠體內(nèi)，6-8周后處死小鼠，流式細(xì)胞術(shù)檢測胸腺細(xì)胞各個組分是否重建。
　　結(jié)果:
　　免疫應(yīng)光化學(xué)顯示:E12.5，E13.5胸腺

10、K5/K8染色中，CARM1-/-胸腺明顯小于同齡對照，但其皮質(zhì)髓質(zhì)分布形式未見異常;E18.5流式細(xì)胞術(shù)顯示CARM1-/-胸腺其內(nèi)皮質(zhì)細(xì)胞(MHCII+Ly51+)及髓質(zhì)細(xì)胞（MHCII+UEA+）的絕對數(shù)量與對照接近，未見異常;及成功構(gòu)建腎下囊同種異體胸腺移植模型后胸腺細(xì)胞得以重建，雖然CARM1-/-數(shù)量較對照稍少，但其比例未見異常。
　　小結(jié):
　　雖然CARM1-/-胸腺小于對照，但是其皮髓質(zhì)分布正常;據(jù)流式細(xì)胞

11、術(shù)，其皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞絕對數(shù)量未見減少;腎下囊同種異體胸腺移植動物模型的建立后相關(guān)分析顯示CARM1-/-胸腺上皮細(xì)胞能夠支持正常前T細(xì)胞的發(fā)育，因此CARM1-/-小鼠的胸腺上皮細(xì)胞數(shù)量及功能未見異常，即CARM1-/-小鼠胚胎中胸腺細(xì)胞發(fā)育缺陷并非由胸腺上皮細(xì)胞引起。
　　第三部分 CARM1在造血過程中的影響
　　目的:
　　觀察CARM1基因敲除后對小鼠胚胎造血過程的影響，追溯其胸腺細(xì)胞數(shù)目減少最早發(fā)生時間，探討

12、CARM1-/-胸腺發(fā)育細(xì)胞發(fā)育阻滯，數(shù)量減少的原因，是否由其上游干細(xì)胞的缺陷引起。
　　方法:
　　培育CARM1-/-胚胎，免疫熒光化學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)檢測不同胎齡CARM1-/-胸腺中早期造血祖細(xì)胞的數(shù)量;競爭性重建實驗:Actin-GFP小鼠與CARM1+/-雜交獲得GFP+CARM1+/-小鼠后，同系繁殖獲得GFP+CARM-/-胚胎，混合相同數(shù)量的GFP+CARM1-/-與GFP-CARM1+/+胸腺細(xì)胞，眼眶后靜脈

13、注射至受體鼠，6-8周后處死受體小鼠，流式細(xì)胞術(shù)分析其胸腺，外周淋巴細(xì)胞各組分是否有效重建。
　　結(jié)果:
　　1.CARM1-/-E12.5 CD45+造血祖細(xì)胞數(shù)目顯著減少，cKit+CD25+染色，顯示早期胸腺細(xì)胞減少改變延續(xù)E13.5乃至E17.5，持續(xù)整個胚胎期;
　　2.CARM1-/-骨髓細(xì)胞總數(shù)顯著減少，KLS亞群的比例和絕對細(xì)胞數(shù)顯著減少;Flk2+MPP減少了95％，LT-HSC和ST-HSC分別減少

14、大約80％;下游的定向分化祖細(xì)胞也受波及，lineageloCD27+Flk2+亞群亞群數(shù)量減少93％。CD27+Flk2+亞群減少85％， CMP和MEP明顯減少分別達(dá)92％和66％，GMP未受影響;
　　3.與骨髓相反，E18.5 CARM1-/-胚胎肝臟的總細(xì)胞數(shù)與對照接近，無顯著差異;CARM1-/-LT-HSC的數(shù)量略為升高，進(jìn)而總KLS細(xì)胞量略高。其他所有造血祖細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異。
　　4.E14.5 GFP+

15、CARM1-/-胚胎肝臟細(xì)胞整體細(xì)胞數(shù)目未見顯著減少，且KLS亞群的比例及比例及絕對數(shù)量未見差異;
　　5.競爭性重建實驗表明，與Carm+/+干細(xì)胞相比，Carm1-/-重建的DN1至CD4SP或CD8SP各個亞群均大幅度減少。在同樣的競爭條件下，Carm1-/-干細(xì)胞分化產(chǎn)生的各亞群細(xì)胞，MEP除外，遠(yuǎn)少于Carm1+/+干細(xì)胞。
　　小結(jié):
　　CARM1-/-骨髓細(xì)胞LT-HSC及其引起的CLP減少，印證E18

16、.5 CARM1-/-觀察到的胸腺細(xì)胞和脾B細(xì)胞的減少。由此，CARM1對于造血早期以及隨后的淋巴分化不可或缺，但是未受影響的GMP亞群反應(yīng)CARM1缺失并不影響遲些的髓系分化。E18.5 CARM1-/-胚胎肝臟的總細(xì)胞數(shù)未見異常， LT-HSC及KLS細(xì)胞量略高，其他造血祖細(xì)胞數(shù)量未見差異，提示CARM1對于維持胚胎肝臟中造血祖細(xì)胞的數(shù)量并非必要。競爭性重建實驗反映Carm1-/-千細(xì)胞造血能力顯著弱于Carm+/+干細(xì)胞。雖然在E

17、14.5 CARM1-/-胚胎肝臟中存在與對照無顯著差異數(shù)量的造血干細(xì)胞，但其造血能力因CARM1基因敲除嚴(yán)重受損。鑒于受體RAG2-/-γc-/-鼠體內(nèi)微環(huán)境CARM1并未敲除，造血干細(xì)胞中內(nèi)源性CARM1在造血過程中必不可少。
　　結(jié)論:
　　1.驗證小鼠體內(nèi)CARM1基因確被敲除;驗證胚胎表型包括胚胎長度為對照60％，胸腺發(fā)育不全，存在DN1-DN2發(fā)育阻滯.
　　2.CARM1-/-胸腺皮髓質(zhì)分布正常;絕對數(shù)量

18、未見減少;腎下囊同種異體胸腺移植動物模型的建立后相關(guān)分析顯示CARM1-/-胸腺上皮細(xì)胞能夠支持正常前T細(xì)胞的發(fā)育， CARM1-/-小鼠胚胎中胸腺細(xì)胞發(fā)育缺陷并非由胸腺上皮細(xì)胞引起。
　　3.CARM1-/-骨髓細(xì)胞LT-HSC及其引起的CLP減少，與E18.5 CARM1-/-觀察到的胸腺細(xì)胞和脾B細(xì)胞的減少呼應(yīng)。CARM1對于造血早期以及隨后的淋巴分化不可或缺，但是未受影響的GMP亞群反應(yīng)CARM1缺失并不影響髓系分化。

19、r>　　4.E18.5 CARM1-/-胚胎肝臟的總細(xì)胞數(shù)未見異常， LT-HSCs及KLS細(xì)胞量略高，其他造血祖細(xì)胞數(shù)量未見差異，提示CARM1對于維持胚胎肝臟中造血祖細(xì)胞的數(shù)量并非必要。
　　5.競爭性重建實驗結(jié)果反映同等條件下，Carm1-/-千細(xì)胞造血能力顯著弱于Carm+/+干細(xì)胞，E14.5 CARM1-/-胚胎肝臟造血干細(xì)胞的造血能力因CARM1基因敲除嚴(yán)重受損。
　　6.鑒于受體RAG2-/-γc-/-鼠體內(nèi)