艾灸對亞健康腦力疲勞模型大鼠學習記憶能力與海馬神經(jīng)元的影響.pdf

1、目的：觀察艾灸“印堂”與“神闕”穴對亞健康腦力疲勞模型大鼠學習記憶能力的影響及其可能機制，為臨床應用艾灸印堂與神闕調(diào)治亞健康腦力疲勞提供現(xiàn)代醫(yī)學理論依據(jù)。本課題的研究目的具體包括以下4個方面。
　　 (1)建立并評價部分睡眠剝奪所致亞健康腦力疲勞大鼠動物模型，觀察艾灸“印堂”與“神闕”穴對模型大鼠學習記憶能力的影響。
　　 (2)探討部分睡眠剝奪對模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamus-pituit

2、ary-adrenocortex axis，HPA)相關(guān)激素水平的影響，觀察艾灸“印堂”與“神闕”穴對HPA軸激素水平的調(diào)節(jié)作用。
　　 (3)觀測部分睡眠剝奪所致亞健康腦力疲勞模型大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學變化，探討艾灸“印堂”與“神闕”穴對海馬神經(jīng)元形態(tài)學的影響。
　　 (4)檢測部分睡眠剝奪所致亞健康腦力疲勞模型大鼠海馬細胞凋亡相關(guān)蛋白表達變化，探討艾灸“印堂”與“神闕”穴對模型大鼠海馬細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。

3、>　　 方法：采用隨機對照的動物實驗研究方法進行本課題研究。實驗分為以下4個部分。
　　 (1)將健康成年SD大鼠30只(雌雄各半)按體重大小及雌雄隨機分成3組：正常組、模型組和艾灸組，每組10只。模型組和艾灸組采用睡眠剝奪水箱進行每天不足5-6小時睡眠的睡眠剝奪，正常組在同一時間段內(nèi)放入模擬水環(huán)境水箱內(nèi)，連續(xù)14天。造模期間，艾灸組另給予艾灸“印堂”與“神闕”穴，每穴每次灸15分鐘，每天1次。觀察3組大鼠的一般狀況，并每周稱

4、重一次。在實驗進行第2周，采用八臂迷宮對3組大鼠進行學習訓練，并檢測其學習記憶能力。
　　 (2)實驗結(jié)束當天，處死大鼠并采血。采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測各組大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素(adronocorticotropic hormone，簡寫為ACTH)和內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，簡寫為GC)濃度。
　　 (3)實驗結(jié)束當天處死大鼠后取材并制作標本。組織病理切片觀察3組大

5、鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學，原位末端標記法(TUNEL法)觀測海馬細胞凋亡情況。
　　 (4)采用免疫組織化學法檢測3組大鼠海馬CA3區(qū)Bcl-2、Bax與Caspase-3等凋亡相關(guān)基因蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果：上述實驗完成后，得到如下觀測結(jié)果。
　　 (1)一般狀況：實驗前，3組大鼠一般狀況好。實驗開始造模初期，模型組與艾灸組大鼠外觀無明顯改變，但其行為的興奮性與警覺性提高，對周圍刺激反應敏捷。隨著造模時

6、間的延長，模型組與艾灸組大鼠披毛毛色逐漸發(fā)黃而少光澤，且開始出現(xiàn)掉毛，表現(xiàn)出易“激惹”現(xiàn)象，對抓取、撫摸等刺激表現(xiàn)出逃避行為。造模1周后，模型組大鼠明顯消瘦，披毛蓬亂，毛色枯黃無光澤且容易掉落，出現(xiàn)疲勞與虛弱行為。正常對照組從實驗開始到結(jié)束，外觀表現(xiàn)大致如實驗前。艾灸組自造模1周起外觀與行為表現(xiàn)介于正常組和模型組之間。
　　 (2)體重變化：正常組實驗第7天與實驗前相比體重增加，但差異無顯著性(P>0.05)；模型組、艾灸組實驗

7、第7天與實驗前相比，體重均減輕，差異有顯著性(P<0.05)；實驗第7天，模型組與艾灸組大鼠體重比較，差異無顯著性(P>0.05)。實驗第7天及第14天，模型組、艾灸組體重與正常組相比為輕，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 (3)八臂迷宮訓練成績：3組大鼠覓食時間比較，模型組最長，艾灸組次之，正常組最短，3組之間兩兩比較，差異均有顯著性(P<0.01)。自訓練測試第3天起，正常組及艾灸組錯誤臂數(shù)與模型組比較均為少(P<0.0

8、5)，艾灸組與正常組錯誤臂數(shù)比較，差異無顯著性(P>0.05)。自訓練測試第5天起，正常組及艾灸組正確臂數(shù)與模型組比較均為多(P<0.05)。
　　 (4)血清ACTH與GC濃度：模型組及艾灸組血清ACTH濃度明顯高于正常組(P<0.05)，艾灸組血清ACTH濃度明顯低于模型組(P<0.05)。模型組血清GC濃度明顯高于正常組(P<0.05)；艾灸組GC濃度明顯低于模型組(P<0.05)，與正常組比較，差異無顯著性(P>0.05

9、)。
　　 (5)海馬切片神經(jīng)元形態(tài)學觀察結(jié)果
　　 海馬切片HE染色后光鏡可見：正常組海馬CA3區(qū)有大量排列規(guī)則整齊的錐體細胞，模型組錐體細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞數(shù)量減少，艾灸組錐體細胞排列比較規(guī)則、整齊。
　　 海馬切片細胞凋亡觀察可見：正常組海馬組織可見少量TUNEL陽性細胞，模型組及艾灸組陽性細胞散布于整個海馬組織；艾灸組陽性細胞數(shù)明顯少于模型組(P<0.05)，艾灸組陽性細胞數(shù)與正常組比較，差異無顯著性(P

10、>0.05)。
　　 (6)海馬切片免疫組化染色后光鏡觀察結(jié)果
　　 Bcl-2蛋白檢測結(jié)果：與正常組比較，模型組、艾灸組Bcl-2蛋白陽性細胞數(shù)目均為多(P<0.05)；艾灸組Bcl-2蛋白陽性細胞數(shù)目較模型組多，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 Bax蛋白檢測結(jié)果：與正常組比較，模型組、艾灸組Bax蛋白陽性細胞數(shù)目均為多(P<0.05)；艾灸組Bax蛋白陽性細胞數(shù)目較模型組少，差異有顯著性(P<0.05)

11、。
　　 Caspase-3蛋白檢測結(jié)果：與正常組比較，模型組與艾灸組Caspase-3蛋白陽性細胞數(shù)目均為多(P<0.05)；艾灸組Caspase-3蛋白陽性細胞數(shù)目較模型組比較少，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 結(jié)論：通過本課題研究，可以得出以下結(jié)論。
　　 (1)采用每天不足5-6小時睡眠、連續(xù)14天的部分剝奪睡眠方法建立的亞健康腦力疲勞大鼠模型，其行為學與人類亞健康腦力疲勞臨床表現(xiàn)相類似，是研究亞健

12、康腦力疲勞較為理想的動物模型。
　　 (2)艾灸“印堂”與“神闕”穴具有改善亞健康腦力疲勞模型大鼠學習記憶能力等亞健康樣癥狀的作用。
　　 (3)HPA軸功能亢進，高GC水平下進而引起的海馬損傷，是亞健康腦力疲勞發(fā)生的機制之一。艾灸“印堂”與“神闕”穴具有調(diào)節(jié)亞健康腦力疲勞模型大鼠HPA軸的功能，這是艾灸能夠改善亞健康腦力疲勞模型大鼠亞健康樣癥狀的機制之一。
　　 (4)艾灸“印堂”與“神闕”穴可以阻止腦力疲勞模

13、型大鼠海馬錐體細胞帶神經(jīng)元丟失，減輕海馬神經(jīng)元損傷，維持海馬神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)；艾灸還可以抑制海馬神經(jīng)細胞的凋亡，保護海馬神經(jīng)元。
　　 (5)睡眠剝奪導致模型大鼠海馬神經(jīng)元Bax與Casepase-3基因蛋白表達增加，促使海馬神經(jīng)細胞凋亡，是亞健康腦力疲勞的又一發(fā)生機制。艾灸“印堂”與“神闕”穴可通過下調(diào)海馬促凋亡蛋白Bax及凋亡相關(guān)酶Casepase-3的表達，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而抑制大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡，保護