Purα蛋白對鋰-匹羅卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及學習記憶的影響.pdf

1、目的：研究purα蛋白對鋰-匹羅卡品致癇大鼠行為學、神經(jīng)元凋亡及認知功能的影響，探討purα對癲癇發(fā)生的預防作用及機制。
　　方法：實驗動物的選擇經(jīng)寧夏醫(yī)科大學倫理委員會批準，按照相應動物實驗操作準則進行。選擇雄性Sparague-Dawley（SD）大鼠。挑選標準為：成年大鼠，6~8周，體重在200~250g之間。飼養(yǎng)條件：避光，適宜的溫度和濕度24小時晝夜循環(huán)。
　　90只SD大鼠隨機分為Purα過表達組、沉默組、對照組

2、共三組，每組30只。每組隨機選取大鼠，以40mg/kg體重標準腹腔注射1％的戊巴比妥鈉溶液進行麻醉。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，確定大鼠海馬CA1區(qū)（前囟后3.6mm，旁開2.2mm，深度2.5mm），用微量注射器緩慢推注4μL慢病毒懸液(5×108TU病毒顆粒)。對照組按上述同樣方法和坐標，注射同等體積生理鹽水完成手術(shù)過程。手術(shù)完畢后將大鼠放回籠內(nèi)單獨飼養(yǎng)且連續(xù)2天給予腹腔注射青霉素5萬U/d防止感染。
　　注射病毒二周后每組隨機選

3、取10只大鼠斷頭取腦，剝離出海馬組織，通過和Western Blotting證實Purα慢病毒已經(jīng)在海馬組織表達；其余每組20只大鼠用匹羅卡品誘導癲癇；根據(jù)Racine評分標準為依據(jù)來判定癲癇發(fā)作級別，若癲癇發(fā)作達到Ⅲ~Ⅴ級則視為成功。若癲癇未發(fā)作或發(fā)作沒有達到Ⅲ級則按要求每30min增加注射一次匹羅卡品，增加劑量為10mg/kg，補充的總注射次數(shù)最多不超過3次。癲癇發(fā)作1小時后觀察記錄大鼠的行為學變化，癲癇發(fā)作3d后每組選取10只大鼠

4、進行水迷宮實驗，實驗設計共5天，可分為空間搜索實驗及定位巡航實驗兩部分。巡航實驗記錄4天(4次/d)，觀察各組大鼠的空間學習能力。第5天進行空間搜索實驗，記錄大鼠在規(guī)定時間內(nèi)穿越平臺象限的次數(shù)及停留時間，作為判斷大鼠空間記憶能力參考指標。其余每組大鼠進行實驗取材，一部分斷頭剝離腦組織取海馬CA1區(qū)組織進行凍存；一部分大鼠行活體灌注取材石蠟包埋；取材進行免疫組織化學檢測Caspase-3表達水平；通過Western-Blot及免疫組織化學

5、檢測海馬神經(jīng)元Caspase-3的表達變化水平。統(tǒng)計分析使用SPSS20.0軟件比較分析，實驗數(shù)據(jù)以X士S來表示。用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計比較，組間比較采用LSD法，當各組的方差不齊時用Dunnett法進行均數(shù)間的兩兩比較。實驗結(jié)果以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：1.Morris水迷宮實驗：Purα沉默組癲癇大鼠與其他兩組相比較，逃避潛伏期時間長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Pu

6、rα過表達癲癇組與癲癇模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著實驗天數(shù)的增加，各組逃避潛伏期也逐漸呈縮短趨勢，Purα過表達癲癇組大鼠與其他兩組相比較，縮短趨勢并不明顯。平臺象限滯留時間三組之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。平臺象限穿越次數(shù)，Purα過表達癲癇組大鼠與沉默組相比較差異有統(tǒng)計學意義，與癲癇模型組相比差異則無統(tǒng)計學意義。
　　2.Purα蛋白在海馬區(qū)域的表達：海馬CA1區(qū)注射高滴度的Purα慢病毒

7、顆粒2周后，提取海馬組織蛋白，免疫印跡結(jié)果顯示Purα蛋白表達量在Purα過表達組表達明顯增高，沉默組則明顯降低；三組之間比較，差異具有統(tǒng)計學意義，說明Purɑ慢病毒對海馬組織進行基因?qū)哟紊系母深A是成功的。
　　3.癲癇大鼠海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果癲癇誘導成功三天后，海馬形態(tài)及病理改變。癲癇模型組細胞排列規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)欠完整。Purα過表達組，細胞排列緊密，結(jié)構(gòu)相對完整清晰，染色質(zhì)均勻分布。沉默組，細胞結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)元變性壞死，間

8、距加大，存在明顯神經(jīng)元凋亡。
　　4.免疫組織化學染色：匹羅卡品誘導大鼠癲癇發(fā)作3d后，與癲癇模型組和沉默組相比，Purα過表達組偶見棕染細胞、著色較淺；癲癇模型組陽性細胞較過表達組多；沉默組，可見大量陽性細胞，其胞漿和胞核內(nèi)均有棕黃色或棕褐色顆粒沉著。說明Purα對癲癇發(fā)作所導致的海馬神經(jīng)元有保護作用，沉默Purα基因的表達，可使得癲癇誘導的神經(jīng)元凋亡加重。
　　5.Western-Blot：Caspase-3的表達水平，