凡納濱對(duì)蝦和三疣梭子蟹滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因的篩選與表達(dá)分析.pdf

1、水生甲殼動(dòng)物的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。本文利用SSH及RACE技術(shù),通過對(duì)凡納濱對(duì)蝦及三疣梭子蟹滲透相關(guān)功能基因的篩選,克隆和表達(dá)研究,研究了鹽度脅迫對(duì)滲透相關(guān)基因的表達(dá)影響,初步探討了甲殼動(dòng)物滲透調(diào)節(jié)機(jī)制,主要包括以下三方面內(nèi)容:
　　(1)鹽度變化下凡納濱對(duì)蝦差異表達(dá)基因的篩選與鑒定、表達(dá)分析;
　　(2)凡納濱對(duì)蝦兩種碳酸酐酶的基因克隆與表達(dá)分析;
　　(3)三疣梭子蟹兩種碳酸酐酶的基因克隆與表達(dá)

2、分析。主要結(jié)果如下:
　　1.鹽度變化下凡納濱對(duì)蝦差異表達(dá)基因的篩選與鑒定、表達(dá)分析
　　本研究利用差異消減雜交(suppression subtractive hybridization;SSH)技術(shù)篩選鹽度變化下凡納濱對(duì)蝦差異表達(dá)基因,并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了鹽度變化下這些基因的表達(dá)量變化。篩選得到與滲透調(diào)節(jié),免疫,呼吸,代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的的基因主要有果糖磷酸激酶、粘附因子、假定蛋白S18_873_0036、

3、假定蛋白BCW_A0010、細(xì)胞色素氧化酶亞型I、延長(zhǎng)因子2,吡啶磷酸脫氫酶及對(duì)蝦白斑病病毒基因等。
　　2.凡納濱對(duì)蝦兩種碳酸酐酶的基因克隆與表達(dá)分析
　　本文克隆了凡納濱對(duì)蝦胞質(zhì)碳酸酐酶基因(cytoplasmic carbonic anydrase,Cac)及磷脂酰肌醇連碳酸酐酶(glycosyl-phosphatidylinositol-linked carbonicanhydrase,Cag)的全長(zhǎng)及部分序列。胞質(zhì)

4、碳酸酐酶基因全長(zhǎng)1161bp,開放閱讀框810bp,共編碼270個(gè)氨基酸,分子量29.45kDa;磷脂酰肌醇連碳酸酐酶現(xiàn)有基因5撇端序列及片段序列908bp,開放閱讀框778bp,編碼268個(gè)氨基酸。
　　組織特異性分析可知,Cac在鰓絲、肌肉、肝胰臟及神經(jīng)節(jié)內(nèi)有較高表達(dá),在血細(xì)胞內(nèi)有少量表達(dá),在心臟內(nèi)不表達(dá),Cag在鰓絲、肌肉及神經(jīng)節(jié)內(nèi)有較高表達(dá),在眼柄及肝胰臟內(nèi)有少量表達(dá),在心臟及血細(xì)胞內(nèi)不表達(dá);進(jìn)化樹分析可知,凡納濱對(duì)蝦Ca

5、c與Cag是碳酸酐酶基因超家族的兩個(gè)亞族,兩者均與蝦類親緣關(guān)系最近,與斑節(jié)對(duì)蝦在一個(gè)支上,與蟹類次之,與昆蟲同屬節(jié)肢動(dòng)物門,而與脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這說明碳酸酐酶進(jìn)化中非常保守;另外DNA比對(duì)可發(fā)現(xiàn)氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)Cag在蛋白的N端比Cac多出一段22個(gè)氨基酸的序列,這即為Cag與細(xì)胞膜結(jié)合的信號(hào)肽區(qū)域。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得知,Cac第80-100個(gè)氨基酸處為其Zn離子結(jié)合位點(diǎn),Cag第105-120個(gè)氨基酸處為其Zn離子結(jié)合位點(diǎn),附近有一個(gè)

6、由Val、Leu、Tyr和Leu所構(gòu)成的疏水口袋和由Thr和His所組成的一個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)移通道,兩種碳酸酐酶均由單一肽鏈組成,每個(gè)肽鏈分子含一個(gè)Zn離子,其中脯氨酸含量最高,無二硫鍵,大量比對(duì)說明3個(gè)組氨酸殘基在鋅離子結(jié)合位點(diǎn)中是保守的His-94,His-96 and His-119。蛋白的N-糖基化位點(diǎn)(211-213aa)被.Met1到Ala18的信號(hào)序列所引導(dǎo),碳酸酐酶基因的研究,為凡納濱對(duì)蝦呼吸及滲透調(diào)節(jié)、體液pH調(diào)節(jié)、機(jī)體鈣化等

7、生理活動(dòng)提供理論依據(jù)。
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了凡納濱對(duì)蝦鹽度變化下兩種CA基因的表達(dá)量變化。結(jié)果表明,Cac不論在鹽度升高還是降低時(shí)表達(dá)量都顯著高于對(duì)照組,而Cag只對(duì)低鹽敏感,在高鹽度下表達(dá)量沒有明顯變化。
　　3三疣梭子蟹兩種碳酸酐酶的基因克隆與表達(dá)分析
　　本文克隆了三疣梭子蟹胞質(zhì)碳酸酐酶基因及磷脂酰肌醇連碳酸酐酶的部分序列。Cac669 Bp cDNA序列,618bp的開放閱讀框,編碼206個(gè)氨基酸;

8、Cag782Bp序列,699bp的開放閱讀框,編碼233個(gè)氨基酸。
　　組織特異性分析可知,Cac及Cag在鰓絲、肌肉、肝胰臟內(nèi)有較高表達(dá),在血細(xì)胞內(nèi)和心臟有少量表達(dá)。Cac在鰓、肌肉及肝胰臟內(nèi)表達(dá)量均高于Cag。進(jìn)化樹分析可知,三疣梭子蟹Cac與Cag是碳酸酐酶基因超家族的兩個(gè)亞族,兩者均與蟹類親緣關(guān)系最近,與蝦類次之,與昆蟲同屬節(jié)肢動(dòng)物門,而與脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這說明碳酸酐酶進(jìn)化中非常保守;另外DNA比對(duì)可發(fā)現(xiàn)氨基酸比對(duì)發(fā)

9、現(xiàn)Cag在蛋白的N端比Cac多出一段22個(gè)氨基酸的序列,這即為Cag與細(xì)胞膜結(jié)合的信號(hào)肽區(qū)域。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)得知,Cac第80-100個(gè)氨基酸處為其Zn離子結(jié)合位點(diǎn),Cag第105-120個(gè)氨基酸處為其Zn離子結(jié)合位點(diǎn),附近有一個(gè)由Val、Leu、Tyr和Leu所構(gòu)成的疏水口袋和由Thr和Hi s所組成的一個(gè)質(zhì)子轉(zhuǎn)移通道,兩種碳酸酐酶均由單一肽鏈組成,每個(gè)肽鏈分子含一個(gè)Zn離子,其中脯氨酸含量最高,無二硫鍵,第211aa-213aa(As

10、n-Ser-Ser)為其N一糖基化位點(diǎn)。大量比對(duì)說明3個(gè)組氨酸殘基在鋅離子結(jié)合位點(diǎn)中是保守的His-94,His-96 and His-119。碳酸酐酶基因的研究,為三疣梭子蟹呼吸及滲透調(diào)節(jié)、體液pH調(diào)節(jié)及機(jī)體鈣化等生理活動(dòng)提供理論依據(jù)。
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了三疣梭子蟹在鹽度變化下兩種CA基因的表達(dá)量變化。結(jié)果表明,Cac不論在鹽度升高還是降低時(shí)表達(dá)量都顯著高于對(duì)照組,而Cag只對(duì)低鹽敏感,在高鹽度下表達(dá)量沒有明顯變化