HECT類泛素連接酶Snurfl活性調(diào)控、新功能及相關(guān)晶體結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、泛素-蛋白酶體途徑是真核細(xì)胞內(nèi)最為重要的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，它通過選擇性清除細(xì)胞內(nèi)錯誤折疊的以及特定環(huán)境下需要降解的蛋白質(zhì)，對維持細(xì)胞正常的生理功能發(fā)揮至關(guān)重要的作用。泛素化修飾的過程是在泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3的順序作用下介導(dǎo)泛素結(jié)合到底物蛋白，最后泛素鏈標(biāo)記的底物蛋白被蛋白酶體識別并在其中降解。整個過程中E3決定了底物蛋白識別的特異性。E3主要分為兩大類：RING類E3和HECT類E3。人們對HECT類E3的功能和

2、活性調(diào)控認(rèn)識主要來自于對Nedd4家族的研究。Nedd4家族E3在TGF-B、EGF、IGF、VEGF、SDF-1以及TNF-α等生長因子或細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路中具有重要的調(diào)控作用。
　　 作為Nedd4家族中的一員，Smurf1是在1999年篩選Smad相互作用蛋白時被發(fā)現(xiàn)可以降解TGF-B/BMP通路中的信號分子Smad1/5。后來又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了Smurf1的其它底物分子如RhoA、Runx2以及磷酸化形式的MEKK2等。S

3、murf1基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠骨表型分析都證明Smurf1在動物成體骨形成中發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)控作用，強有力提示Smurf1是一個具有重要潛在價值的增強成骨細(xì)胞功能以治療骨病的藥物靶點。但是其調(diào)控分子，特別是可以調(diào)控其E3活性的調(diào)控分子一直沒有被發(fā)現(xiàn)。
　　 2005年Science雜志的一篇關(guān)于大規(guī)模相互作用蛋白篩選的研究報道酪蛋白激酶相互作用分子CKIP-1可能與Smurf1具有相互作用，但未做深入研究，這對相互作用的生化與生理

4、功能均不清楚。CKIP-1首先被發(fā)現(xiàn)是酪蛋白激酶CK2的一個相互作用蛋白，本實驗室在人胎肝轉(zhuǎn)錄組的研究中也曾克隆鑒定到此基因，成為國際上最早克隆此基因的實驗室之一，并對其功能與調(diào)控開展了近十年的研究?；诜肿雍图?xì)胞水平的研究表明它在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞骨架調(diào)控以及募集ATM和CK2到質(zhì)膜定位中發(fā)揮作用，但是CKIP-1在動物整體水平上的體內(nèi)生理功能一直不清楚。
　　 我們對Smurf1與CKIP-1的相互作用及意義進(jìn)行了深入

5、的研究。首先證實CKIP-1可以特異的與Smurf1結(jié)合進(jìn)而增強其E3活性，而與同家族的其它成員都沒有相互作用。CKIP-1是第一個被發(fā)現(xiàn)的Smurf1活性增強因子。有意思的是，CKIP-1特異結(jié)合Smurf1分子中介導(dǎo)底物識別的兩個WW結(jié)構(gòu)域之間一段僅由15個氨基酸組成的連接區(qū)，而這段連接區(qū)在Smurf1與Nedd4家族其它成員之間存在序列差異，通過這種特異的靶向作用，CKIP-1上調(diào)Smurf1的E3活性、增強Smurf1與底物的結(jié)

6、合力、進(jìn)而促進(jìn)Smurf1底物的泛素化降解。這是第一次揭示Smurf1的WW結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)也可以介導(dǎo)與其它蛋白的結(jié)合并在Smurf1的活性調(diào)控中發(fā)揮非常重要的功能。這種活性調(diào)控機制不同于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HECT類型E3的調(diào)控機制，因而代表了一種全新的泛素連接酶活性調(diào)節(jié)機制。在E3研究中長期存在的一個問題是為什么序列相近的E3成員具有不同的底物特異性和調(diào)控機制。我們的精細(xì)分析表明Smurf1 WW連接區(qū)的單個氨基酸的突變即可以導(dǎo)致E3結(jié)合調(diào)

7、控分子及底物選擇的改變，從而解釋了為什么結(jié)構(gòu)相似的E3如Smurf1和Smurf2，雖然序列高度同源但底物識別有所區(qū)別以及活性調(diào)控方式不同的問題。
　　 在動物生理水平，CKIP-1基因敲除后小鼠骨量會隨年齡增加而升高，成骨細(xì)胞功能增強，Smurf1的活性減弱。這不但是第一次真正闡明CKIP-1的生理功能，成為數(shù)量很少的成骨細(xì)胞功能調(diào)控成員中新的一員，更為重要的是證明CKIP-1對Smurf1的活性調(diào)控可以在生理水平發(fā)生而且對于

8、骨形成具有重要的負(fù)調(diào)控作用，從而揭示了WW連接區(qū)介導(dǎo)的E3活性調(diào)控機制的真實性與重要性。CKIP-1與Smurf1的相互作用特別是介導(dǎo)結(jié)合的Smurf1的WW連接區(qū)成為具有重大篩選意義和應(yīng)用前景的骨質(zhì)疏松藥物的潛在靶標(biāo)。
　　 為發(fā)現(xiàn)更多Smurf1的調(diào)節(jié)分子和底物，我們以Smurf1的WW結(jié)構(gòu)域為誘餌通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到了TRAF4為其新的相互作用蛋白。TRAF4是TRAF家族成員。TRAF家族分子作為胞內(nèi)接頭蛋白，可以介

9、導(dǎo)NF-κB和JNK-AP1通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而參與骨代謝、先天性和獲得性免疫、炎癥應(yīng)激響應(yīng)等多種生物學(xué)過程。我們證實TRAF4是Smurf1的一個新的底物分子。當(dāng)擴(kuò)展到其他TRAF家族成員時，我們發(fā)現(xiàn)Smurf1對其它TRAF分子都可以進(jìn)行泛素化修飾，而且逆轉(zhuǎn)它們在NF-κB通路中的作用。我們的研究把Smurf1的底物范圍擴(kuò)展到TRAF家族，表明Smurf1在免疫和炎癥反應(yīng)中也具有調(diào)控作用，從而增加了人們對Smurf1新功能的認(rèn)識。<

10、br>　　 Smurf1的C2結(jié)構(gòu)域不但可以影響其自身泛素化，而且可以結(jié)合磷脂、從而對其定位和功能也具有重要的作用。我們對此結(jié)構(gòu)域進(jìn)行蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析并得到了精細(xì)的空間結(jié)構(gòu)信息。Smurf1-C2由兩組4個B片層形成的片層組和兩端的loop組成，屬于C2結(jié)構(gòu)域家族中的class II類型。結(jié)構(gòu)分析表明，Smurf1-C2結(jié)合磷脂的模式可能不同于PKC蛋白。對C2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)解析將有助于發(fā)現(xiàn)針對C2結(jié)構(gòu)域并影響Smurf1整體分子功能的

11、藥物。
　　 綜上，我們的研究結(jié)果第一次證明Smurf1的WW結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)對于E3復(fù)合體的形成及E3活性的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要功能，并揭示了CKIP-1是第一個增強Smurf1活性的重要輔助因子，而且CKIP-1對Smurf1的這種活性增強作用在動物整體水平得到了驗證。我們進(jìn)一步的研究把Smurf1的底物范圍擴(kuò)展到TRAF家族，表明Smurf1可能通過調(diào)控TRAF家族在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。對影響Smurf1功能的C2結(jié)構(gòu)域進(jìn)