大豆E3泛素連接酶基因GmARI的克隆與功能驗證.pdf

1、大豆是世界上重要的油料作物，也是植物蛋白的主要來源之一。世界上酸性土壤占可耕土地面積的40％，占非可耕土地面積的70％，在我國酸性土壤占全國土地面積的21％，酸性土壤中的鋁毒是我國南方地區(qū)影響大豆產(chǎn)量的重要因素，大豆耐酸鋁的機(jī)理尚不十分清楚，限制了分子育種工作的開展，因此，發(fā)掘大豆耐鋁的基因資源，研究耐鋁機(jī)理將促進(jìn)大豆耐鋁的種質(zhì)培育和改良。前人在大豆的耐鋁種質(zhì)資源篩選、耐鋁相關(guān)QTL定位等方面已經(jīng)做了大量工作，為培育耐鋁大豆新品種和耐鋁

2、基因的發(fā)掘奠定了良好的基礎(chǔ)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程原理培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、耐逆的大豆新品種受到越來越多研究者的關(guān)注.大豆遺傳轉(zhuǎn)化是基因功能研究以及分子育種應(yīng)用的基礎(chǔ)，但大豆的遺傳轉(zhuǎn)化中還存在諸多困難，建立成熟穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系是大豆基因工程育種的關(guān)鍵所在。
　　 本研究在實驗室前期定位基礎(chǔ)上結(jié)合大豆基因組信息和基因的功能預(yù)測選擇耐鋁候選基因，并對候選基因進(jìn)行克隆和功能驗證;同時，在前人研究的基礎(chǔ)上選用再生能力較好的7

3、份大豆材料進(jìn)行叢生芽率比較試驗，并對轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行改進(jìn)。主要結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)耐鋁毒QTL定位和候選基因功能預(yù)測的E3連接酶基因序列，克隆得到兩個基因，預(yù)測其含有ARIADNE結(jié)構(gòu)域，因此分別命名為GmARI(Glycine maxARIADNE)1，GmARI2.
　　 序列分析顯示GmARI1基因全長為2042 bp; GmARI2全長2022 bp，ORF均為1758bp，編碼586個氨基酸。其中GmARI1

4、基因位于11號染色體上耐鋁性狀QTL定位的區(qū)段（GMKF046-Sat_128）內(nèi)，而GmARI2基因位于12號染色體上。兩個基因均含有15個外顯子和14個內(nèi)含子，這兩個基因編碼的蛋白均屬于RBR蛋白亞家族，在223-266氨基酸殘基位點有典型的IBR(C6HC)結(jié)構(gòu)域，兩邊分別含有一個RING結(jié)構(gòu)域。目前，RBR結(jié)構(gòu)域在植物中的研究較少，在大豆中尚未有相關(guān)報道，組織表達(dá)分析顯示這兩個基因在根、莖、葉、莖尖生長點、花和種子中均有表達(dá)。亞

5、細(xì)胞定位結(jié)果表明GmARI1和GmARI2蛋白均定位于細(xì)胞核內(nèi)，推測兩個基因可能是在核中參與蛋白泛素修飾途徑。Real-time PCR的結(jié)果顯示，GmARI1和GmARI2兩個基因在Al3+，Na+，JA，Man，IAA，ACC，SA和GA3處理下的表達(dá)量均有所增加，根中的變化趨勢比葉子中的明顯，這與前人研究中鋁毒對植物的危害主要表現(xiàn)在根上這一說法一致，且GmARI1基因在各處理下的表達(dá)量都比GmAR2要高。推測GmARI1基因很可能

6、參與耐鋁相關(guān)途徑。用15μM Al3+(pH4.3)處理轉(zhuǎn)GmARI1和GmARI2基因的擬南芥植株，轉(zhuǎn)GmARI1基因的植株根系顯著長于野生型，結(jié)合Real-time PCR結(jié)果，推測GmARI1基因的過量表達(dá)能夠提高植物的耐鋁性。
　　 2.在轉(zhuǎn)基因大豆方法研究中，對不同材料叢生芽率的比較發(fā)現(xiàn)大粒黃和Williams的叢生芽率較高，且綜合表現(xiàn)較好。以大粒黃為受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到16株抗卡那霉素（Kan）的轉(zhuǎn)基因苗，涂抹