E3泛素連接酶RNF128在抗病毒天然免疫中的調(diào)控功能及其分子機(jī)制.pdf

1、研究目的
　　天然免疫是機(jī)體抵御外界病毒感染的第一道防線。機(jī)體通過模式識(shí)別受體(patternrecognitionreceptor，PRR)，包括Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)、RIG-Ⅰ樣受體(Retinoticacid-inducedinducedgeneⅠlikereceptors,RLRs)、NOD樣受體(Nucleotidebindingoligomerizationdomainlik

2、ereceptorsNLRs)和多種DNA受體等，識(shí)別病原微生物的重要成分即病原相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMP)，分別激活各自相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終誘導(dǎo)一系列炎性因子以及干擾素(Interferons，IFNs)的表達(dá)和分泌。其中炎性因子能夠進(jìn)一步激活天然免疫細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，并啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答;而IFNs在機(jī)體中具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用，但是異常

3、的IFNs信號(hào)會(huì)誘發(fā)各種免疫性疾病，因此，精準(zhǔn)地調(diào)控IFNs對(duì)于維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)具有非常重要的意義。
　　E3泛素連接酶RNF128(GRAIL，generelatedtoanergyinlymphocytes)是一類在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，RNF128可以通過多種機(jī)制誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞失能。RNF128通過泛素化作用不僅可以降解TCR-CD3(T細(xì)胞活化所需的第一信號(hào))，還可以降解CD40L、CD83和C

4、D151（T細(xì)胞活化所需的第二信號(hào)及共刺激信號(hào)），另外，RNF128還可以可以降解T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞(antigen-presentingcell，APC)接觸時(shí)免疫突觸形成的重要蛋白（Arp2/3和Coronin1A）。大量的研究也證明，調(diào)節(jié)T細(xì)胞失能的其它幾個(gè)E3泛素連接酶Cbl-b，c-Cbl和Itch都可以參與天然抗病毒反應(yīng)。但是RNF128在固有免疫反應(yīng)中是否發(fā)揮作用還未見報(bào)道。
　　為了研究RNF128在天然免疫反應(yīng)

5、中的功能，我們深入探討了RNF128對(duì)IFNs信號(hào)通路的影響，并闡明了相關(guān)的分子機(jī)制，希望為一些免疫相關(guān)性疾病的治療的研究提供新的參考和方向。
　　研究方法
　　1.分別用poly(I∶C)、ISD、SeV或HSV-1轉(zhuǎn)染或感染小鼠原代巨噬細(xì)胞和人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)RNF128的表達(dá);
　　2.利用RNF128特異性siRNA分別抑制小鼠巨噬細(xì)胞和THP-1細(xì)胞RNF128表達(dá)后，Realtim

6、equantitativePCR(qRT-PCR)檢測(cè)poly(I∶C)、ISD、SeV、HSV-1誘導(dǎo)表達(dá)的Ifnb1、Il6、Tnfa、Cxcl10、Mx1及Ccl5表達(dá)變化;
　　3.通過qRT-PCR及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)尋找RNF128影響IFN-β信號(hào)通路的靶基因;通過免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)及免疫熒光(Immunofluorescence，IF)檢測(cè)RNF128與TBK

7、1的相互作用;
　　4.通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和和泛素化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNF128對(duì)TBK1泛素化的影響，利用TBK1磷酸化位點(diǎn)突變體探討RNF128對(duì)TBK1泛素化的位點(diǎn)，以及RNF128對(duì)感染后細(xì)胞的TBK1激酶活性的影響;
　　5.體外水平，空斑試驗(yàn)檢測(cè)RNF128沉默或過表達(dá)后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞感染RNA病毒或DNA病毒后的抗病毒能力;體內(nèi)水平，尾靜脈注射的方法對(duì)Rnf128-/-小鼠分別感染VSV或HSV-1，檢測(cè)血清及肝、肺或腦

8、中病毒復(fù)制情況，并觀察對(duì)小鼠生存率的影響。
　　結(jié)果
　　1.病毒感染后誘導(dǎo)RNF128表達(dá)上調(diào)
　　為了研究RNF128是否在固有免疫信號(hào)通路中發(fā)揮作用，我們首先用poly(I∶C)和ISD刺激小鼠原代巨噬細(xì)胞和人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RNF128的mRNA和蛋白水平在刺激后都明顯升高。類似的，RNA病毒SeV和DNA病毒HSV-1感染小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞和人THP-1細(xì)胞也誘導(dǎo)RNF128在mRNA和蛋白水平

9、表達(dá)上調(diào)。
　　重組IFN-β刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞后，RNF128表達(dá)水平隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高;封閉了IFN-β受體的實(shí)驗(yàn)組在接受病毒誘導(dǎo)后，RNF128的表達(dá)升高被抑制了;沉默了小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞中STAT1和STAT2的表達(dá)，也明顯抑制了SeV-或HSV-1病毒誘導(dǎo)的RNF128表達(dá)升高。
　　2.RNF128正調(diào)IRF3活性和IFN-β信號(hào)通路
　　由于病毒感染引起機(jī)體的一個(gè)主要效應(yīng)就是誘導(dǎo)產(chǎn)生IF

10、N-β，我們想進(jìn)一步探討RNF128在IFN-β信號(hào)通路中的作用。在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和人THP1細(xì)胞中的研究結(jié)果均顯示通過siRNA沉默RNF128后再分別轉(zhuǎn)染Poly(I∶C)、ISD或感染SeV、HSV-1，會(huì)顯著抑制Poly(I∶C)、ISD、SeV和HSV-1誘導(dǎo)的Ifnb1及下游相關(guān)ISG基因，包括Cxcl10，Mx1和Ccl5表達(dá)水平，而不影響Il6和Tnfa的表達(dá)。轉(zhuǎn)染Poly(I∶C)、ISD或感染SeV、HSV-1后，

11、Rnf128-/-小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)與分泌水平與WT組相比明顯被抑制，IFN-β下游的Cxcl10，Mx1以及Ccl5基因的mRNA水平也顯著低于WT組，而Il6和Tnf表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。在HEK293細(xì)胞中我們發(fā)現(xiàn)RNF128表達(dá)降低能夠明顯抑制TRIF信號(hào)通路以及DNA信號(hào)通路和RNA信號(hào)通路活化對(duì)IFN-β啟動(dòng)子及mRNA的影響。
　　IFN-β的啟動(dòng)子區(qū)域有三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，分別是IRF3，

12、NF-κB和AP-1。NF-κB和AP-1分別結(jié)合到PRDⅡ和Ⅳ區(qū)域，IRF3則結(jié)合到PRDⅠ-Ⅲ區(qū)域。RNF128過表達(dá)能夠增強(qiáng)TRIF-，MAVS和cGAS+STING誘導(dǎo)的IFN-β活性及PRDⅠ-Ⅲ報(bào)告基因活性，而對(duì)PRDⅡ和Ⅳ的報(bào)告基因活性沒有顯著影響。說明RNF128通過影響IRF3進(jìn)而影響IFN-β的表達(dá)。
　　轉(zhuǎn)錄因子IRF3的磷酸化、二聚化以及入核是IRF3活化過程的三個(gè)必要步驟，活化的IRF3才能進(jìn)一步結(jié)合到I

13、FN-β的啟動(dòng)子區(qū)域，影響IFN-β的表達(dá)。我們分別向HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染RNF128過表達(dá)載體以及TRIF-，MAVS和cGAS+STING過表達(dá)載體，檢測(cè)IRF3的磷酸化，發(fā)現(xiàn)RNF128過表達(dá)均能夠增強(qiáng)上述信號(hào)通路活化引起的IRF3的磷酸化水平。我們進(jìn)一步以野生型和RNF128缺陷小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，分別用SeV病毒和HSV-1病毒感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RNF128缺陷組腹腔巨噬細(xì)胞的二聚化現(xiàn)象較野生組明顯減弱。SeV病

14、毒感染野生組腹腔巨噬細(xì)胞后，IRF3和P6均明顯入核，而RNF128缺陷組IRF3的入核明顯受到了抑制，P65入核與對(duì)照組相比沒有明顯變化;同樣HSV-1病毒感染后的結(jié)果類似。
　　3.RNF128作用靶點(diǎn)為TBK1
　　我們以HEK293細(xì)胞為研究對(duì)象，共轉(zhuǎn)染了RNF128過表達(dá)質(zhì)粒以及TRIF-，cGAS+STING-，RIG-IN-，MAVS-，TBK1-以及IRF35D過表達(dá)質(zhì)粒，RNF128過表達(dá)組與對(duì)照組相比，T

15、RIF-，cGAS+STING-，RIG-IN-，MAVS-和TBK1-誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)和啟動(dòng)子活性均增強(qiáng)，但是對(duì)IRF35D誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)及報(bào)告基因活性沒有影響;隨后，我們又通過RNF128特異性小干擾RNA沉默HEK293細(xì)胞中的RNF128表達(dá)，同樣轉(zhuǎn)入TRIF-，cGAS+STING-，RIG-IN-，MAVS-，TBK1-以及IRF35D過表達(dá)質(zhì)粒，RNF128沉默降低了TRIF-，cGAS+STING-，RIG-I

16、N-，MAVS-和TBK1-誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)及啟動(dòng)子活性，但是對(duì)IRF35D誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)和啟動(dòng)子活性沒有影響。
　　免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-IP)結(jié)果顯示，RNF128只能夠與TBK1發(fā)生相互作用，而與其他接頭分子沒有相互作用。我們又通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果顯示二者間存在微弱的共定位，當(dāng)激活細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路后，共定位現(xiàn)象明顯增強(qiáng)。免疫熒光的結(jié)果與Co-IP結(jié)果一致。
　　4.RNF128促進(jìn)TBK

17、1發(fā)生K63泛素化
　　向HKE293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染Myc-TBK1、V5-RNF128野生型和突變載體以及泛素化(Ub)表達(dá)載體，Co-IP結(jié)果顯示RNF128過表達(dá)確實(shí)能夠增強(qiáng)TBK1的泛素化。體外的泛素化系統(tǒng)同樣檢測(cè)到TBK1的泛素化現(xiàn)象。向HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)入了RNF128和TBK1的過表達(dá)質(zhì)粒以及野生型(HA-Ub)和突變型的泛素化質(zhì)粒，HA-ubiquitin-K48和HA-ubiquitin-K63，結(jié)果顯示RNF1

18、28過表達(dá)誘導(dǎo)TBK1的泛素化主要是K63位泛素化，而對(duì)TBK1K48位泛素化沒有影響。而TBK1K30或K401位突變后，泛素化作用明顯減弱，當(dāng)這兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變后，泛素化作用減弱更加明顯。
　　5.RNF128促進(jìn)TBK1激酶活性
　　為了研究RNF128介導(dǎo)的TBK1泛素化是否影響TBK1的活性，我們分別檢測(cè)了WT和Rnf128-/-小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞感染SeV病毒和HSV-1病毒后，TBK1激酶活性，發(fā)現(xiàn)Rnf128

19、-/-組的巨噬細(xì)胞感染病毒后TBK1激酶活性也明顯低于WT組。在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)RNF128后再感染SeV病毒與對(duì)照組相比則顯著增強(qiáng)TBK1激酶活性;而通過siRNA沉默RNF128后再感染SeV病毒與對(duì)照組相比則顯著抑制TBK1激酶活性。我們又以Tbk1-/-MEFs細(xì)胞為研究對(duì)象，通過電轉(zhuǎn)分別轉(zhuǎn)入Myc-TBK1-WT、Myc-TBK1-K30R、Myc-TBK1-K401R和Myc-TBK1-K30R-K401R表達(dá)質(zhì)粒。

20、Myc-TBK1-WT轉(zhuǎn)入組檢測(cè)到顯著的TBK1激酶活性以及TBK1磷酸化和Ifnb1表達(dá)，而轉(zhuǎn)入RNF128過表達(dá)載體能夠進(jìn)一步增強(qiáng)TBK1磷酸化和Ifnb1表達(dá)，而TBK1-K30R、TBK1-K401R和TBK1-K30R-K401R轉(zhuǎn)入組過表達(dá)RNF128并不能增強(qiáng)TBK1磷酸化和Ifnb1表達(dá)。
　　6.RNF128調(diào)節(jié)TBK1活性具有普遍性
　　已有文獻(xiàn)報(bào)道MIB1、MIB2和Nrdp1能夠促進(jìn)TBK1發(fā)生K63

21、泛素化。為了研究MIB1、MIB2和Nrdp1的泛素化功能與RNF128對(duì)TBK1活性調(diào)控的關(guān)系，我們分別設(shè)計(jì)了MIB1、MIB2和Nrdp1的siRNA，并轉(zhuǎn)入Rnf128-/-的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中。LPS誘導(dǎo)后，siRNA沉默MIB1/MIB2組與對(duì)照組相比能夠顯著抑制SeV-誘導(dǎo)的Ifnb1表達(dá)以及IRF3和TBK1磷酸化，而LPS-或HSV-1-感染后則沒有這種差異;siRNA沉默Nrdp1組與對(duì)照組相比能夠顯著抑制Ifnb1表

22、達(dá)以及IRF3和TBK1磷酸化，而SeV-或HSV-1-感染后則沒有這種差異。
　　7.RNF128能夠增強(qiáng)機(jī)體抗病毒能力
　　IFN-β的主要功能就是抗病毒感染，下面我們想繼續(xù)探討RNF128對(duì)抗病毒功能的影響。我們以野生型和RNF128缺陷小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，分別感染了VSV和HSV-1病毒，通過空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度，結(jié)果顯示RNF128缺陷組不論被RNA病毒還是DNA病毒感染后，病毒滴度都比野生組顯著升高

23、。體外試驗(yàn)證明，RNF128可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗病毒能力，我們?nèi)∫吧秃蚏NF128缺陷小鼠各3只，尾靜脈注射VSV或HSV-1后檢測(cè)血清中IFN-β的水平，發(fā)現(xiàn)不論是RNF病毒還是DNA病毒感染后，缺陷組血清中IFN-β水平都顯著低于野生組;3天后，將小鼠處死，對(duì)VSV感染組，分別檢測(cè)小鼠肝和肺中VSV病毒的滴度和復(fù)制，發(fā)現(xiàn)Rnf128-/-組顯著高于WT組;對(duì)于HSV-1感染組，檢測(cè)腦組織中HSV-1病毒的滴度和復(fù)制，同VSV組一樣，缺

24、陷組病毒滴度和復(fù)制水平較野生組組顯著升高。致死實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RNF128缺陷組小鼠，不管對(duì)VSV還是HSV-1，都更易被感染，生存率降低。
　　結(jié)論
　　1.細(xì)胞感染RNA或DNA病毒后可以誘導(dǎo)RNF128表達(dá)升高。
　　2.RNF128正調(diào)控IRF3活性進(jìn)而正向調(diào)控IFN-β信號(hào)通路。
　　3.RNF128作用靶點(diǎn)為TBK1。
　　4.RNF128能夠促進(jìn)TBK1發(fā)生K63泛素化
　　5.RNF128能夠

25、增強(qiáng)TBK1激酶活性
　　6.RNF128對(duì)TBK1的活性調(diào)控具有普遍性
　　7.RNF128能夠促進(jìn)細(xì)胞或機(jī)體的抗病毒能力
　　創(chuàng)新性和研究意義
　　1.本研究首次發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶RNF128除了具有調(diào)控適應(yīng)性免疫反應(yīng)的功能外，在天然抗病毒免疫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用，豐富我們對(duì)RNF128在免疫反應(yīng)中功能的認(rèn)識(shí)。
　　2.本研究中，我們闡明了RNF128正向調(diào)控IFN-β信號(hào)通路的分子機(jī)制。我們首次明確T