重組泛素連接酶對肺癌靶向治療的初步探討.pdf

1、肺癌是目前全世界最常見的惡性腫瘤，其死亡率居世界首位。非小細胞肺癌是肺癌中最常見的一類，多數非小細胞肺癌的細胞中均有表皮生長因子受體（EGFR）和該家族別的成員表達。EGFR是跨膜受體型酪氨酸激酶家族的一員，EGFR家族（ErbB家族）主要有四名成員，在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，目前以EGFR為治療靶點的靶向治療取得了令人鼓舞的成就。小分子EGFR受體型酪氨酸激酶抑制劑（TKI）如厄洛替尼和吉非替尼已開展了較為深入的臨床試驗。這

2、兩種藥物對10％-20%的非小細胞肺癌患者有較為明確的治療效果。但是，臨床結果證實，多數患者在治療一段時間后出現(xiàn)耐藥。目前認為腫瘤細胞能通過多種單獨或者聯(lián)合的途徑獲得耐藥的能力，現(xiàn)階段比較公認的機制主要有：EGFR基因獲得性二次突變，MET基因異常高擴增以及 HGF異常高表達等。目前腫瘤耐藥已經成為腫瘤治療中最大的障礙，對腫瘤聯(lián)合用藥有非常好的治療前景，我們期望能探索一種安全有效地治療方法，以提高腫瘤治療的效率。既然EGFR及其家族成員

3、對肺癌的發(fā)生和發(fā)展十分重要，我們希望有更多的新的方式來干預這些靶點。理論上，只要設計合理，我們能通過泛素化作用降解任意的蛋白質，從而為腫瘤治療提供新的思路。泛素化最早被描述成為細胞內清除短效的，受損的或者異常的蛋白的一種方式。然而，隨著當今研究的進展，越來越多的發(fā)現(xiàn)證實泛素化參與細胞內更多的活動，其地位與磷酸化越來越相近。泛素化的過程就是泛素激活酶E1將活化的泛素分子轉移到E2結合酶上，之后，泛素連接酶E3結合攜帶著泛素分子的泛素結合酶

4、E2，通過連接酶E3的轉移作用，泛素分子被轉移到底物蛋白上，這整個過程就是泛素化修飾。最后經過泛素化修飾的蛋白質被運送到蛋白酶體，并被降解的過程。本研究通過構建能夠靶向性識別和結合EGFR及其家族成員的受體型酪氨酸激酶結構域的重組泛素連接酶，利用具有泛素連接酶E3活性的Cbl的RING結構域和CHIP的U-box結構域行使泛素化、降解功能，通過泛素化作用，下調腫瘤細胞中EGFR的水平，最終實現(xiàn)抑制腫瘤的目的。這與傳統(tǒng)的靶向治療策略相比，

5、此方法具有能夠同時針對幾個具有相同結合結構域的靶蛋白并直接降低其蛋白質水平的優(yōu)勢，同時泛素化能夠有效避免靶蛋白發(fā)生繼發(fā)突變而導致耐藥。在利用泛素化靶向治療肺癌的同時，我們期望能利用此種技術為肺癌患者提供更多的益處。晚期肺癌患者，一旦出現(xiàn)肺癌骨轉移以后，疾病基本沒有治愈的機會，為了提高患者生活質量，我們期望能用泛素化技術抑制轉移瘤對骨的破壞。轉移瘤對骨的溶骨性破壞一般由破骨細胞活性增強引起，而不是腫瘤細胞直接多骨組織的作用。在破骨細胞的活

6、化過程中，RANKL-OPG-RANK信號通路發(fā)揮著關鍵的作用。在此信號通路中，RANKL有著共同的接頭蛋白—TRAF家族蛋白，TRAF家族多個成員均以與TRIP(TRAF-interacting protein)結合。我們計劃利用能與TRAF蛋白靶向結合的TRIP C端的coiled-coiled結構域構建泛素重組連接酶，靶向降解TRAF家族蛋白，從而抑制破骨細胞的活性，最終達到抑制骨破壞的作用，提高患者的生活質量。
　　在本研

7、究的第一部分實驗中，我們通過重組PCR，將接頭分子Shc、Grb2分別能夠與磷酸化的EGFR結合的PTB結構域（Phosphotyrosine Binding domain）和SH2（Src-homology region 2）結構域的基因以及TRIP C端的coiled-coiled結構域與CHIP的U-box結構域基因或者Cbl的RING（Y371E）結構域基因進行基因融合，將構建好的融合基因連接到真核表達載體pFLAG-CMV4里

8、，構建具有目的特異性的重組泛素連接酶。接下來，在實驗二中，我們首先篩選了最適宜的肺癌細胞系，并且檢測了重組泛素連接酶在肺癌細胞系和293T細胞系中對靶蛋白的降解作用。在第三部分實驗中，我們從功能角度檢測了重組泛素連接酶對Spc-A1細胞系的惡性表性的影響。在實驗四中，我們初步探討了重組泛素連接酶對與肺癌骨轉移的保護作用及其機制。
　　實驗一：設計引物，利用普通PCR分別擴增Shc的PTB結構域基因、Grb2的SH2結構域基因以及T

9、RIP C端的coiled-coiled結構域、CHIP的U-box結構域基因和點突變Cbl的RING（Y371E）結構域基因，利用重組PCR將SH2、PTB以及TRIP與U-box、PTB與RING（Y371E）分別進行基因融合，獲得的產物分別命名為SH2- RING（Y371E）、SH2-U-box和PTB-U-box以及 TRIP-U-box。將融合基因產物雙酶切處理，插入真核表達載體pFLAG-CMV4。經過酶切鑒定和測序驗證，

10、重組質粒構建成功。
　　實驗二：首先從腫瘤細胞轉染效率和內源性EGFR表達量的角度篩選最合適的肺癌細胞系。分別用構建成功的重組泛素連接酶與EGFR質粒共轉染293T細胞系，并用重組泛素連接酶轉染 EGFR高表達的肺癌細胞系，分別設立實驗組，陰性對照組和空白對照組，檢測重組泛素連接酶對靶蛋白水平的影響，結果顯示三種重組泛素連接酶均能不同程度的降解靶蛋白。證明靶蛋白下降后，設計引物并進行Real-time PCR實驗，檢測重組泛素連接

11、酶對靶蛋白的mRNA的影響，以證明重組泛素連接酶的干預作用是在翻譯后水平。
　　實驗三：根據實驗二的結果，進一步進行細胞學實驗，分別設立實驗組，陰性對照組和空白對照組，利用MTT比色實驗、平板克隆形成實驗以及Transwell實驗檢測重組泛素連接酶對腫瘤細胞的增殖能力和轉移侵襲能力的影響；將重組質粒與多西他賽聯(lián)合用藥檢測重組質粒對多西他賽的協(xié)同作用。結果顯示，兩種重組泛素連接酶能夠明顯的抑制腫瘤細胞的增殖和轉移侵襲能力，能顯著促使

12、腫瘤細胞凋亡。
　　實驗四：將構建成功的重組泛素連接酶與接頭蛋白TRAF2、6共同轉染293T細胞系，設立 pFLAG-CMV4-TRIP-U-box為實驗組，pFLAG-CMV4-TRIP為陰性對照組和空載體pFLAG-CMV4為對照，檢測重組泛素連接酶對靶蛋白水平的影響，免疫印跡結果顯示重組泛素連接酶pFLAG-CMV4-TRIP-U-box能促使靶蛋白表達下調。利用免疫共沉淀證實重組泛素連接酶pFLAG-CMV4-TRIP-

13、U-box能夠與TRAF6直接結合。直接證明了兩者間的相互作用。
　　綜上所述，在多種腫瘤細胞中都存在RTK的異常活化和過度表達，靶向降解這些分子是行之有效的抑制腫瘤的方法。EGFR是RTK家族中的重要成員，參與腫瘤細胞的惡性轉化。雖然目前針對EGFR的靶向治療面對著耐藥的巨大挑戰(zhàn)，但是它們依舊是腫瘤治療中的理想靶位。泛素化是一種常見的翻譯后修飾方式，通過泛素化修飾介導蛋白質的泛素-蛋白酶體降解途徑，理論上能夠使任意底物蛋白發(fā)生降