CUL4BE3泛素連接酶調(diào)控HBV復(fù)制的分子機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)屬于嗜肝DNA病毒科，感染肝細(xì)胞后可以引起急性肝炎、慢性肝炎和重型肝炎。雖然乙肝疫苗的應(yīng)用使HBV感染率有所下降，但目前全世界仍有20億人感染HBV，其中約3.5億人是HBV慢性感染者，仍然是肝細(xì)胞肝癌(HCC)發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重危害人類的健康。因此，研究HBV復(fù)制的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)能夠清除HBV感染、阻斷HBV相關(guān)疾病發(fā)展的潛在靶點(diǎn)，將為臨床診治提供新的契機(jī)。
　　

2、泛素蛋白酶體途徑可通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)的泛素化修飾，促進(jìn)體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的眾多生物學(xué)功能，在維持細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要作用。在真核細(xì)胞中，泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3共同催化泛素分子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)的泛素化降解。其中，E3泛素連接酶通過特異性地識別底物蛋白，介導(dǎo)泛素高特異性的連接到不同的蛋白質(zhì)上，在此途徑中扮演著重要的角色。近年來，有研究證明泛素蛋白酶體途徑參與調(diào)控HBV的復(fù)制周期。使用蛋白酶

3、體抑制劑硼替佐米(bortezomib)注射HBV轉(zhuǎn)基因小鼠能夠顯著降低HBVDNA的含量，同時(shí)，干擾素抑制HBV的復(fù)制依賴于蛋白酶體的活性。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠以及注射了HBV全基因表達(dá)質(zhì)粒的C57BL/6小鼠中發(fā)現(xiàn)使用蛋白酶體抑制劑MLN-273卻能促進(jìn)HBV的復(fù)制。因此蛋白酶體途徑與HBV復(fù)制之間的關(guān)系還不是很清楚。
　　CUL4B是近年在X連鎖精神發(fā)育遲滯疾病中克隆、發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新致病基因，其突變可以引起患者智

4、力低下、失語、巨大舌、身材矮小等。CUL4B屬于Cullin-RING基因家族的一員。人體內(nèi)已經(jīng)鑒定存在8個(gè)Cullin家族基因，分別為CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7和PARC，每一個(gè)cullin蛋白都能組裝成獨(dú)特的E3泛素連接酶復(fù)合物，參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞的增生與分化、DNA復(fù)制與修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒感染等各種細(xì)胞生命過程，對維持細(xì)胞的正常生理功能具體非常重要的作用。
　　關(guān)于CUL4

5、BE3泛素連接酶是否參與調(diào)節(jié)HBV復(fù)制，目前尚無報(bào)道。因此，本課題對于CUL4BE3泛素連接酶在HBV感染中的作用及其分子機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。
　　研究目的:
　　1.研究CUL4B對HBV復(fù)制的影響。
　　2.探討CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的分子機(jī)制，為抗病毒治療方案提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.CUL4B對HBV復(fù)制的調(diào)控作用
　　1.1臨床標(biāo)本和HBV轉(zhuǎn)基因鼠分析CUL4B與HBV復(fù)制

6、的相關(guān)性
　　1.1.1臨床肝組織標(biāo)本中分析CUL4B與HBV復(fù)制的相關(guān)性
　　收集43例HBV陽性的肝組織標(biāo)本，提取肝組織RNA，real-timePCR檢測CUL4BmRNA、HBVpgRNA的水平;提取肝組織基因組DNA，real-timePCR檢測HBVcccDNA;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CUL4B表達(dá)水平與HBV復(fù)制指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　1.1.2HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中分析CUL4B與HBV的復(fù)制的相關(guān)性
　　6～8

7、周齡雄性、BalB/C系HBVTg鼠，提取肝臟組織的RNA，利用real-timePCR檢測CUL4BmRNA、HBVpgRNA的水平，提取肝組織基因組DNA，real-timePCR檢測HBVcccDNA;分離小鼠血清，real-timePCR檢測血清中HBVDNA水平;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CUL4B表達(dá)水平與HBV復(fù)制相應(yīng)指標(biāo)之問的相關(guān)性。
　　1.2CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的體內(nèi)研究
　　1.2.1利用CUL4B轉(zhuǎn)基因鼠研究CU

8、L4B對HBV復(fù)制的影響
　　6～8周齡雄性CUL4B轉(zhuǎn)基因鼠（CD1系，EGFP-CUL4BTg）及相應(yīng)野生型小鼠，尾靜脈高壓注射HBV全基因組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1，ELISA方法檢測外周血HBsAg、HBeAg水平，real-timePCR方法檢測兩組小鼠肝組織CUL4BmRNA、HBVcccDNA、HBVpgRNA水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CUL4B與HBV復(fù)制指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　1.2.2利用Mx1-CreC

9、UL4BFlox/Y條件敲除鼠研究CUL4B對HBV復(fù)制的影響
　　6～8周齡雄性條件性CUL4B基因敲除鼠(C57BL/6系，Mx1-CreCUL4BFlox/Y)及其相應(yīng)野生型小鼠，PIPC處理5天后，尾靜脈高壓注射HBV全基因組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HBV1.1，ELISA方法檢測外周血HBsAg、HBeAg水平，real-timePCR方法檢測兩組小鼠肝組織CUL4BmRNA、HBVcccDNA、HBVpgRNA水平，統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)分析CUL4B與HBV復(fù)制相應(yīng)指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　1.3CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的體外研究
　　HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染CUL4B-mi表達(dá)質(zhì)粒或陰性對照Neg-mi表達(dá)質(zhì)粒，BEL7402細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、Hela細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)HBV全基因組表達(dá)質(zhì)粒和CUL4B-miRNA或陰性對照Neg-miRNA質(zhì)粒，或在HepG2細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染CUL4B過表達(dá)質(zhì)粒和HBV全基因組表達(dá)質(zhì)粒。利用Westernblot、Re

11、al-timePCR方法檢測CUL4B的干擾或過表達(dá)效果以及HBVcccDNA，HBVpgRNA水平，ELISA方法檢測細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg水平，分析CUL4B過表達(dá)或沉默對HBV復(fù)制水平的影響。
　　2.HBx在CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制中的作用
　　將CUL4B過表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒分別與pcDNA3-HBV1.1（HBx蛋白野生型組）或pcDNA3-HBV1.1(△HBx)（HBx蛋白表達(dá)缺失組）或pcDNA3-

12、HBV1.1(△HBx)+pcDNA3-HBx-HA（HBx拯救組）共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中。ELISA檢測HBsAg、HBeAg的分泌，real-timePCR檢測CUL4BmRNA、HBVpgRNA、HBVcccDNA水平，分析HBx在CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制中的作用。
　　3.HBx蛋白參與CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制的的機(jī)制研究
　　3.1HBx蛋白與CUL4B復(fù)合體的結(jié)合作用
　　將HBx過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293

13、細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24h后用免疫共沉淀裂解液處理細(xì)胞，收獲蛋白收獲蛋白利用HA抗體或CUL4B抗體進(jìn)行免疫共沉淀，Westernblot檢測CUL4B、DDB1、Roc1和HBx-HA的表達(dá)情況，驗(yàn)證HBx與CUL4B復(fù)合體的相互結(jié)合作用。
　　3.2CUL4B復(fù)合體對HBx蛋白表達(dá)的影響
　　將HBx表達(dá)質(zhì)粒與CUL4B過表達(dá)質(zhì)?；駽UL4B-miRNA或相關(guān)對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、SMMC7721細(xì)胞，

14、通過RT-PCR和westernblot驗(yàn)證CUL4B對HBx表達(dá)的影響;將CUL4B拯救質(zhì)粒與HBx表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CUL4B低表達(dá)的HEK293細(xì)胞、Hela細(xì)胞，Westernblot檢測HBx蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證CUL4B對HBx表達(dá)的影響。此外，將HBx表達(dá)質(zhì)粒與DDB1siRNA或ROC1siRNA共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，Westernblot檢測HBx蛋白的表達(dá)情況，驗(yàn)證DDB1、ROC1對HBx表達(dá)的影響。
　

15、　3.3CUL4B對HBx蛋白半衰期的影響
　　將HBx表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CUL4B低表達(dá)或?qū)φ誋EK293細(xì)胞，經(jīng)蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)處理后，收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞蛋白，westernblot檢測HBx蛋白的表達(dá)變化，觀察CUL4B對HBx蛋白半衰期的影響。
　　3.4CUL4B對HBx蛋白降解的調(diào)控作用
　　將CUL4BsiRNA或陰性對照NCsiRNA與HBx表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、He

16、pG2細(xì)胞、SMMC7721細(xì)胞，并用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞，Westernblot檢測HBx蛋白的表達(dá)變化，明確CUL4B對HBx蛋白降解的調(diào)控作用。
　　3.5CUL4B對HBx蛋白泛素化修飾的影響
　　將HBx過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CUL4B低表達(dá)或?qū)φ誋EK293細(xì)胞，蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞后，利用HA抗體進(jìn)行免疫共沉淀，westernblot檢測泛素分子的表達(dá)，觀察CUL4B對HBx蛋白泛素化修飾的影響

17、。
　　研究結(jié)果：
　　1.CUL4B正向調(diào)控HBV的復(fù)制
　　1.1臨床標(biāo)本和HBV轉(zhuǎn)基因鼠中CUL4B表達(dá)與HBV復(fù)制呈現(xiàn)正相關(guān)性
　　1.1.1臨床肝組織標(biāo)本中CUL4B表達(dá)與HBV復(fù)制水平呈正相關(guān)
　　Real-timePCR檢測HBV陽性肝組織中CUL4B、HBVpgRNA和HBVcccDNA表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，CUL4BmRNA水平與HBV陽性患者肝組織中HBVpgRNA和HBVcccDN

18、A水平均呈現(xiàn)正相關(guān)性。
　　1.1.2HBV轉(zhuǎn)基因鼠中CUL4B表達(dá)與HBV復(fù)制水平呈現(xiàn)正相關(guān)性
　　Real-timePCR檢測HBV轉(zhuǎn)基因鼠肝組織中CUL4B、HBVpgRNA和HBVcccDNA表達(dá)及血清中HBVDNA水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，CUL4BmRNA水平與HBV轉(zhuǎn)基因鼠肝組織中HBVpgRNA、HBVcccDNA水平及血清中HBVDNA水平均呈現(xiàn)正相關(guān)性。
　　1.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)CUL4B可促進(jìn)HBV

19、復(fù)制
　　1.2.1CUL4B轉(zhuǎn)基因鼠可上調(diào)HBV復(fù)制水平
　　CUL4B轉(zhuǎn)基因鼠和野生型對照小鼠經(jīng)尾靜脈高壓注射HBV表達(dá)質(zhì)粒后，Real-timePCR結(jié)果顯示:CUL4B轉(zhuǎn)基因鼠肝臟組織中CUL4BmRNA顯著高于野生型對照組小鼠，同時(shí)肝組織中pgRNA、cccDNA表達(dá)水平亦顯著升高;ELISA結(jié)果顯示:CUL4B轉(zhuǎn)基因小鼠血清中HBsAg、HBeAg水平明顯高于野生型小鼠，提示CUL4B高表達(dá)可正向調(diào)節(jié)HBV復(fù)制。

20、
　　1.2.2Mx1-CreCUL4BFlox/Y基因敲除鼠可抑制HBV復(fù)制
　　Mx1-CreCUL4BFlox/Y小鼠與野生型對照小鼠經(jīng)PIPC處理后，尾靜脈高壓注射HBV表達(dá)質(zhì)粒，Real-timePCR結(jié)果顯示:Mx1-CreCUL4BFlox/Y小鼠肝臟組織中CUL4BmRNA明顯低于對照組，同時(shí)pgRNA、cccDNA水平顯著降低;ELISA結(jié)果顯示:Mx1-CreCUL4BFlox/Y小鼠血清中HBsAg、H

21、BeAg水平顯著低于野生型小鼠，進(jìn)一步提示CUL4B可在體內(nèi)促進(jìn)HBV復(fù)制。
　　1.3體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證CUL4B對HBV復(fù)制的正向調(diào)節(jié)作用
　　肝癌細(xì)胞系過表達(dá)CUL4B表達(dá)、轉(zhuǎn)染HBV基因表達(dá)質(zhì)粒后，CUL4B過表達(dá)可上調(diào)細(xì)胞中pgRNA、cccDNA水平及上清中HBsAg、HBeAg水平;與之相反，干擾肝癌細(xì)胞中CUL4B表達(dá)，可下調(diào)細(xì)胞中pgRNA、cccDNA水平及上清中HBsAg、HBeAg水平，進(jìn)一步驗(yàn)證了C

22、UL4B對HBV復(fù)制的促進(jìn)作用。
　　2.HBx蛋白參與CUL4B對HBV復(fù)制的調(diào)節(jié)作用
　　HepG2細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染CUL4B表達(dá)質(zhì)粒與HBV全基因表達(dá)質(zhì)粒、HBx缺失型HBV質(zhì)粒HBV(△HBx)或經(jīng)HBx質(zhì)粒拯救的HBx缺失型HBV質(zhì)粒后，與HBV全基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，HBx缺失型HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中pgRNA、cccDNA水平和HBsAg、HBeAg分泌水平顯著降低，而HBx表達(dá)質(zhì)?？苫謴?fù)HBx缺失型HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)

23、染細(xì)胞的復(fù)制水平，進(jìn)一步證實(shí)HBx在HBV復(fù)制中的重要作用。CUL4B過表達(dá)可顯著上調(diào)HBV全基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞中pgRNA、cccDNA水平和HBsAg、HBeAg分泌水平，而對HBV(△HBx)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中病毒復(fù)制的影響有所減弱，HBx過表達(dá)可恢復(fù)CUL4B對HBV(△HBx)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中病毒復(fù)制的促進(jìn)作用。
　　3.CUL4B調(diào)控HBx蛋白泛素化降解過程
　　3.1HBx可與CUL4B復(fù)合體相結(jié)合
　　HEK293細(xì)胞過表

24、達(dá)HBx，轉(zhuǎn)染24h后用免疫共沉淀裂解液裂解細(xì)胞，收獲蛋白進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)，Westernblot結(jié)果顯示，HBx可以與CUL4B、DDB1、ROC1相互結(jié)合。
　　3.2CUL4B復(fù)合體上調(diào)HBx蛋白的表達(dá)
　　肝癌細(xì)胞、HEK293細(xì)胞和Hela細(xì)胞中，過表達(dá)或干擾CUL4B觀察HBxmRNA和蛋白的表達(dá)變化。RT-PCR結(jié)果顯示:過表達(dá)或干擾CUL4B對HBxmRNA水平無明顯影響;westernblot結(jié)果顯示:過

25、表達(dá)CUL4B能夠上調(diào)HBx蛋白的表達(dá)，相反地，干擾CUL4B能夠抑制HBx蛋白的表達(dá)，且CUL4B拯救質(zhì)粒能夠劑量依賴性地恢復(fù)CUL4B低表達(dá)細(xì)胞中HBx蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果提示，CUL4B能夠上調(diào)HBx蛋白的表達(dá)。HEK293細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染DDB1siRNA、ROC1siRNA，Westernblot結(jié)果顯示:干擾DDB1或ROC1的表達(dá)均可以抑制HBx蛋白的表達(dá)，以上結(jié)果提示:CUL4B復(fù)合體可上調(diào)HBx蛋白的表達(dá)。
　　3.

26、3CUL4B可延長HBx蛋白的半衰期
　　為進(jìn)一步研究CUL4B影響HBx蛋白表達(dá)的分子機(jī)制，課題檢測了CUL4B對HBx蛋白半衰期的影響。經(jīng)蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)處理后不同時(shí)間點(diǎn)，CUL4B低表達(dá)的穩(wěn)篩細(xì)胞系HEK293中HBx蛋白的表達(dá)顯著低于對照組細(xì)胞。且CUL4B低表達(dá)細(xì)胞中HBx蛋白的降解速率顯著高于對照組細(xì)胞。提示:CUL4B通過延長HBx半衰期進(jìn)而上調(diào)HBx蛋白的表達(dá)。
　　3.4CUL4B抑制HBx

27、蛋白的蛋白酶體降解途徑
　　已有研究證實(shí)，HBx蛋白主要通過泛素-蛋白酶體途徑降解。為研究蛋白酶體降解途徑在CUL4B調(diào)控HBx蛋白表達(dá)中的作用，課題利用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞，westernblot結(jié)果顯示:干擾CUL4B表達(dá)可顯著降低HBx的表達(dá)，而MG132可逆轉(zhuǎn)CUL4B低表達(dá)對HBx蛋白表達(dá)的抑制作用。提示CUL4B可能通過影響泛素-蛋白酶體途徑調(diào)控HBx蛋白的表達(dá)。
　　3.5CUL4B抑制HBx蛋白泛

28、素化修飾
　　為進(jìn)一步研究泛素-蛋白酶體降解途徑在CUL4B調(diào)控HBx蛋白表達(dá)中的作用，課題檢測了CUL4B對HBx泛素化修飾的影響。利用HA抗體進(jìn)行免疫共沉淀，westernblot檢測泛素水平，結(jié)果顯示CUL4B低表達(dá)細(xì)胞中HBx-HA的泛素化水平顯著高于對照組細(xì)胞，提示CUL4B可通過抑制HBx蛋白的泛素化修飾，進(jìn)而阻斷HBx蛋白的蛋白酶體降解途徑。
　　研究結(jié)論與研究意義：
　　1.首次發(fā)現(xiàn)CUL4BE3泛素連