水稻JAZ家族抗逆相關(guān)基因的鑒定和功能分析.pdf

1、植物感受干旱、高鹽等逆境，激發(fā)內(nèi)源信號傳遞系統(tǒng)，調(diào)節(jié)非生物脅迫應(yīng)答和適應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而適應(yīng)不利環(huán)境。水稻對非生物逆境脅迫的響應(yīng)涉及到生理和分子水平的調(diào)控過程。尋找抗逆相關(guān)的調(diào)控基因?qū)﹃U明水稻對非生物逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)制以及指導(dǎo)水稻抗逆性遺傳改良具有重要意義。JAZ是茉莉酸信號響應(yīng)途徑中的負(fù)調(diào)控因子。水稻中大部分JAZ家族的基因都受到非生物逆境脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。我們對6個在逆境脅迫芯片數(shù)據(jù)中受到誘導(dǎo)表達(dá)的JAZ基因轉(zhuǎn)化水稻品種中花11(O

2、ryza sativaL.ssp japonica)。對超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行進(jìn)行了苗期逆境脅迫表型篩選。其中兩個基因（OsJAZ1和OsJAZ9）的轉(zhuǎn)基因材料分別對干旱和鹽脅迫表現(xiàn)出較為明顯的表型。本研究對這兩個參與到JA信號傳遞和非生物逆境脅迫應(yīng)答的JAZ基因做了更加深入的功能分析。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、臤sJAZ1受到逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。OsJAZ1的超量表達(dá)植株相比對照旱敏感，而對ABA處理相比對照不敏感;而OsJAZ

3、1功能缺失突變體植株相比對照抗旱，卻對ABA處理相比對照敏感。OsJAZ1功能缺失突變體材料中干旱脅迫后上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目比與OsJAZ1的超量表達(dá)植株和野生型的干旱誘導(dǎo)上調(diào)的基因數(shù)目明顯要多。OsJAZ1在酵母中與OsMYC2互作，它和OsCOI1a的互作依賴于冠菌素。OsJAZ1超量表達(dá)和OsJAZ1功能缺失突變體的表型可能和ABA響應(yīng)的基因有關(guān)，篩選酵母雙雜交文庫獲得一個OsJAZ1的互作蛋白bZIP類型轉(zhuǎn)錄因子OsBZ8，雙分子

4、熒光互補(bǔ)實驗和酵母雙雜交點對點實驗驗證了OsJAZ1能和它互作。OsJAZ1和OsBZ8的全長在酵母中都沒有轉(zhuǎn)錄激活活性。OsBZ8的表達(dá)量受到逆境誘導(dǎo)表達(dá)，其啟動子上有多個逆境相關(guān)的順式作用元件。熒光素酶實驗結(jié)果說明OsJAZ1具有轉(zhuǎn)錄抑制子的功能。OsBZ8能夠結(jié)合到多個ABA相關(guān)基因的啟動子的ABRE順式作用元件上。OsJAZ1能抑制OsBZ8的轉(zhuǎn)錄激活活性。此外，OsJAZ1也可以與OsNINJA互作，它們可能和OsBZ8組成的

5、蛋白復(fù)合體調(diào)控下游基因的表達(dá)，繼而調(diào)控水稻對干旱脅迫的應(yīng)答。
　?、芆sJAZ9抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的表型是相比對照對鹽脅迫敏感。OsJAZ9超量表達(dá)和OsJAZ9抑制表達(dá)材料鹽脅迫之后地上部分的Na+/K+也顯著不同。OsJAZ9抑制表達(dá)材料對JA敏感表型以及酵母雙雜交和pull-down實驗結(jié)果都驗證了OsJAZ9和OsCOI1a的互作，這也說明OsJAZ9在JA信號傳遞中起著作用。OsAKT1，OsHAK10，OsHAK21和

6、OsHAK27的表達(dá)模式在OsJAZ9的超量表達(dá)和抑制表達(dá)植株之中不同。受到JA處理調(diào)控的三個離子通道轉(zhuǎn)運蛋白OsSKC1，OsHAK21和OsHAK27在OsJAZ9超量表達(dá)材料中對JA處理的表達(dá)模式和野生型以及OsJAZ9抑制表達(dá)材料相反。通過酵母雙雜交文庫篩選篩選到了OsJAZ9的互作蛋白OsNINJA和OsbHLH062。雙分子熒光以及酵母雙雜交的實驗結(jié)果都說明了OsJAZ9可以和水稻bHLH轉(zhuǎn)錄因子OsbHLH062和OsNI

7、NJA互作。OsNINJA能和水稻中大部分JAZ蛋白互作。OsNINJA和OsJAZ9的TIFY結(jié)構(gòu)域互作，而OsbHLH062和OsJAZ9的Jas結(jié)構(gòu)域互作，OsNINJA和OsbHLH062與OsJAZ9的互作位點沒有重合部分。OsbHLH062只能和水稻中的OsJAZ8，OsJAZ9和OsJAZ11這三個JAZ蛋白互作。酵母單雜交和凝膠電泳遷移的實驗結(jié)果說明OsbHLH062能夠特異結(jié)合到同時受OsJAZ9和JA調(diào)控的離子通道蛋

8、白基因啟動子的順式作用元件E-box上。用水稻原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)對OsbHLH062，OsNINJA和OsJAZ9的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明OsbHLH062能夠激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，而OsNINJA和OsJAZ9自身是轉(zhuǎn)錄抑制子，也能抑制OsbHLH062介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活。這些結(jié)果表明OsNINJA-OsJAZ9-OsbHLH062以轉(zhuǎn)錄復(fù)合體形式調(diào)控JA響應(yīng)相關(guān)下游基因的表達(dá)，繼而影響水稻對外界脅迫的響應(yīng)。
　?、乔叭藞蟮乐?/p>

9、JAZ蛋白的互作蛋白很多，但關(guān)于互作蛋白和復(fù)合體在非生物逆境中應(yīng)答起到的作用卻很少報道。本研究著重研究了水稻中兩個不同的JAZ蛋白及其互作的轉(zhuǎn)錄激活類型的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄抑制子OsNINJA的相互作用對非生物逆境應(yīng)答的影響，其中OsJAZ1的互作蛋白OsBZ8結(jié)合到ABRE順式作用元件上調(diào)控ABA響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄;OsJAZ9的互作蛋白OsbHLH062結(jié)合到離子轉(zhuǎn)運通道蛋白基因的啟動子的E-box順式作用元件上調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果加深了對