水稻逆境相關(guān)基因的遺傳轉(zhuǎn)化和功能鑒定.pdf

1、非生物逆境脅迫，如干旱、鹽及低溫等是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素，嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量，甚至導(dǎo)致植物死亡。利用基因工程手段提高植物的抗逆性已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的一項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容。在非生物逆境脅迫條件下，信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵基因能夠調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)和功能基因的表達(dá)，一些重要的調(diào)節(jié)基因和功能基因在轉(zhuǎn)基因株中的超量表達(dá)，往往能使植物獲得更強(qiáng)的抗逆性。 本研究以水稻為材料，開(kāi)展了水稻逆境相關(guān)基因的研究。在分析5個(gè)抗逆候選基因的逆境表達(dá)、組織特異性表達(dá)

2、的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了遺傳轉(zhuǎn)化載體并進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化，系統(tǒng)地進(jìn)行了超表達(dá)、拷貝數(shù)檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因水稻抗旱、耐鹽性鑒定，并分離鑒定了逆境誘導(dǎo)基因OCPI1的啟動(dòng)子，為抗逆轉(zhuǎn)基因水稻的培育以及水稻抗逆機(jī)理研究提供了大量有參考價(jià)值的數(shù)據(jù)和結(jié)論。研究獲得的主要結(jié)果如下： 1．對(duì)5個(gè)逆境誘導(dǎo)表達(dá)基因(本文稱候選基因)構(gòu)建了12個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化載體并轉(zhuǎn)化水稻品種中花11。 2．分析了5個(gè)候選基因干旱、鹽脅迫和脫落酸(ABA)處理下的誘導(dǎo)表達(dá)量，其中

3、3個(gè)基因，OsCK1(編碼一個(gè)CIPK家族的蛋白激酶)，OsDhnI(編碼一個(gè)脫水素同源蛋白)和OCPI1(編碼一個(gè)蛋白酶抑制子)的表達(dá)被多種逆境脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，表現(xiàn)出很大的逆境相關(guān)性，因此確定為本研究的重點(diǎn)研究基因。 3．對(duì)候選基因產(chǎn)生的全部T0轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了PCR陽(yáng)性檢測(cè)(90％植株為陽(yáng)性)，對(duì)7個(gè)超表達(dá)載體產(chǎn)生的總計(jì)139棵轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行了超量表達(dá)檢測(cè)(不同constma的轉(zhuǎn)基因植株超表達(dá)率大約都在50％-60％之間)

4、，確定了81個(gè)超表達(dá)的家系。檢測(cè)了55個(gè)超量表達(dá)家系的拷貝數(shù)(單拷貝的比例在30％以上)，確定了超表達(dá)、單拷貝的轉(zhuǎn)基因家系。 4．對(duì)OsCK1，OsDhnI，OCPI1的超表達(dá)、單拷貝轉(zhuǎn)基因家系于武漢、海南進(jìn)行了孕穗至開(kāi)花期的田間干旱脅迫，考種后結(jié)果顯示OsDhnI、OCPI1轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量及結(jié)實(shí)率均顯著高于對(duì)照中花11，同時(shí)這2個(gè)基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因家在含鹽(100 mM NaCl)培養(yǎng)基上也顯示了比對(duì)照更強(qiáng)的耐鹽性，表明超表達(dá)

5、OsDhnI、OCPI1有助于水稻抗逆性的提高。對(duì)OCPI1轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)源糜蛋白酶受到了一定的抑制。 5．分離了候選基因OCPI1的啟動(dòng)子，對(duì)該啟動(dòng)子控制的GUS報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株的多種組織進(jìn)行了GUS染色，發(fā)現(xiàn)GUS在所檢測(cè)的組織中均有一定程度的表達(dá)。對(duì)該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Northem及GUS定量分析發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)活性，并且用該啟動(dòng)子序列的反義鏈構(gòu)建的GUS融合載體轉(zhuǎn)化水