玉米EXPANSIN家族胚乳特異表達(dá)基因鑒定及ZmEXPB13功能分析.pdf

1、玉米是最重要的糧食作物之一，不但為人類和動(dòng)物提供糧食，而且還為工業(yè)生產(chǎn)提供重要的原材料。提高種子大小對(duì)于提高作物產(chǎn)量至關(guān)重要，種子大小性狀由種子細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)目共同決定，因此，促進(jìn)種子細(xì)胞體積增大是提高作物產(chǎn)量的重要途徑之一。研究表明，expansin蛋白能夠激活細(xì)胞壁的疏松，在調(diào)控細(xì)胞大小上起著重要的作用。胚乳作為種子的一個(gè)重要組成部分，所以充分理解其發(fā)育對(duì)于提高玉米產(chǎn)量很重要，而挖掘出影響玉米胚乳細(xì)胞生長(zhǎng)大小的相關(guān)功能基因?qū)μ岣哂?/p>

2、米產(chǎn)量具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)手段，對(duì)玉米expansin基因家族進(jìn)行了鑒定，分析玉米expansin基因家族的基因結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系，并利用多種方式分析這些基因的表達(dá)模式，篩選出胚乳特異性表達(dá)expansin基因，同時(shí)利用過量表達(dá)技術(shù)分析了玉米ZmEXPB13基因的功能，此外，還對(duì)expansin基因的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，獲得以下主要結(jié)果：
　　1.通過Blast同源搜索，從玉米B73基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定了88個(gè)e

3、xpansin蛋白序列，并根據(jù)進(jìn)化關(guān)系將它們分為3個(gè)亞家族（EXPA、EXPB和EXPLA）。通過基因結(jié)構(gòu)和基序特征分析表明玉米 expansin基因序列高度保守。而染色體定位顯示88個(gè)基因隨機(jī)分布在10條染色體（第8號(hào)染色體除外）上。對(duì)玉米expansin基因復(fù)制事件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)5對(duì)片段復(fù)制和5對(duì)串聯(lián)復(fù)制，表明這兩種復(fù)制在玉米expansin基因擴(kuò)張歷程中共同起作用。
　　2.分別利用三種基因表達(dá)模式分析方法（EST、半定量P

4、CR和基因芯片）分析玉米88個(gè)ZmEXPs基因的表達(dá)模式，并鑒定玉米胚乳特異性表達(dá)ZmEXPs基因。選擇胚乳特異表達(dá)基因 ZmEXPB13作為目標(biāo)基因，并從玉米 B73自交系中克隆了ZmEXPB13基因，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞壁。
　　3.分別構(gòu)建ZmEXPB13基因過量表達(dá)載體35S::ZmEXPB13和GLU::ZmEXPB13，并通過水稻遺傳轉(zhuǎn)化、PCR檢測(cè)以及 Gus染色分別獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株16株

5、和18株。經(jīng)Southern檢測(cè)T0代轉(zhuǎn)基因植株，共獲得6個(gè)單拷貝的轉(zhuǎn)基因株系（13-3、13-10、13-13；13G-3、13G-5、13G-10），這些株系被進(jìn)一步用于ZmEXPB13的功能研究。
　　4.對(duì)6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（過量表達(dá)ZmEXPB13基因）籽粒特征分析顯示：轉(zhuǎn)基因植株的籽粒其長(zhǎng)度和百粒重兩性狀的變化均達(dá)到顯著水平。通過石蠟切片和透射電鏡在亞細(xì)胞水平上分析發(fā)現(xiàn)，不同的轉(zhuǎn)基因株系籽粒的胚乳細(xì)胞大小顯著增大，胚乳細(xì)胞

6、壁厚度顯著增加，而且出現(xiàn)明顯的胞間層。同樣在35S::ZmEXPB13轉(zhuǎn)基因株系根系中觀察到中柱鞘細(xì)胞和內(nèi)皮層細(xì)胞也具有眀顯增大效應(yīng)，這表明 ZmEXPB13基因具有促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)張和增大功能。在胚乳中過量表達(dá) ZmEXPB13基因可促進(jìn)胚乳細(xì)胞增大，從而導(dǎo)致籽粒增大和重量增加，對(duì)提高作物產(chǎn)量可能具有重要作用。
　　5.通過對(duì)玉米expansin基因上游啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，所有的玉米expansin基因上游2kb啟動(dòng)子區(qū)域都包

7、含ABA或者GA作用元件，表明在發(fā)育過程中，ABA或GA一定程度下調(diào)控expansin基因的表達(dá)。利用定量PCR技術(shù)分析玉米胚乳中表達(dá)的ZmEXPs基因表達(dá)模式，結(jié)果顯示，用ABA或GA3處理玉米胚乳（授粉10天）后，這些基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，為研究expansin蛋白的作用機(jī)制提供了重要的參考。
　　綜上所述，本研究在玉米全基因組水平上共鑒定出88個(gè)ZmEXPs基因，并對(duì)expansin基因家族的基因結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系以及多種