ADSCs在組織工程化軟組織當中的應用與研究.pdf

1、1、目的：
　　 隨著在組織工程技術(shù)及再生醫(yī)學的發(fā)展，組織工程技術(shù)在角膜、肝、胰、軟骨、骨、血管、尿道、神經(jīng)系統(tǒng)等領(lǐng)域均取得了巨大的成就，而組織工程技術(shù)在整形外科的應用還處于起步階段。具有“主動修復功能”和“可調(diào)控生物響應特性”的第三代含有干細胞的復合組織材料成為當前的研究熱點和未來的發(fā)展方向。然而，目前含有干細胞的復合組織材料仍有很多問題尚未解決，如復合組織材料在組織修復再生過程中與宿主間相互作用的機理尚不清楚。材料在體內(nèi)的轉(zhuǎn)

2、歸、對宿主局部微環(huán)境及全身防御和再生體系的影響尚不確定等。上述問題極大地阻礙了復合組織材料的開發(fā)與應用。
　　 本實驗以脂肪來源干細胞(Adipose-derivedstemcellsADSCs)為種子細胞，以可以注射的游離脂肪顆粒、透明質(zhì)酸凝膠（hyaluronicacidHA）為細胞支架材料，構(gòu)建含有干細胞的復合組織材料。通過研究含有干細胞的復合組織材料在組織修復再生過程中與宿主的相互作用，闡明復合組織材料在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸、對宿

3、主微環(huán)境及全身的影響，揭示復合組織材料與宿主相互作用的調(diào)控機制;建立新型復合組織材料的篩選、研發(fā)的理論體系和關(guān)鍵技術(shù)，為臨床應用提供科學依據(jù)。
　　 2、方法：
　　 2.1、脂肪來源干細胞的分離提取培養(yǎng)及鑒別
　　 1)ADSCs分離，脂肪組織來源于整形外科脂肪抽吸病人，患者自愿捐獻自體脂肪組織用于本次試驗。2）膠原酶消化法提取脂肪來源性干細胞，分離、收集原代ADSCs按4×105有核細胞/ml細胞密度接種于培

4、養(yǎng)瓶內(nèi)，常用的75mm塑料培養(yǎng)瓶接種細胞，加入低糖DMEM+10％FBS完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。用胰酶消化傳代，收集第3代細胞作為種子細胞和檢測對象。3）流式細胞儀測定干細胞表面標記物CD34、CD49、CD105等，該方法僅用以證明該細胞群有干細胞特性，不影響最終實驗結(jié)果。
　　 2.2、細胞—生物支架復合物取材、制備和植入:
　　 以脂肪顆粒和透明質(zhì)酸為支架材料，和種子細胞混合制成細胞-生物支架復合物，本次實驗共分5組:組①

5、以ADSCs為種子細胞按25×106個/ml濃度與純化后的脂肪顆粒1∶1等體積混合配置成ADSCs+游離脂肪顆粒復合物;組②以單純ADSCs為一組，將ADSCs配置成濃度為12.5×106個/ml懸液備用;組③以單純純化過的脂肪顆粒為一組;組④ADSCs按25×106個/ml濃度與醫(yī)用透明質(zhì)酸以1∶1等體積混合;組⑤單純透明質(zhì)酸組;。按每組0.2ml注射至裸鼠(12只，5W雄性)背部皮下，形成5個點，每組各1個點，觀察裸鼠植入后的生命體

6、征及局部炎癥反應情況，3個月后取材，用于檢測與分析。將取材所獲得的新生組織分別從體積、質(zhì)量、組織學、mRNA表達、Ⅰ型膠原蛋白表達等方面進行研究。
　　 3、結(jié)果：
　　 本次試驗12只裸鼠局部植入填充物后生命體征平穩(wěn)，每只裸鼠注射部位均未見明顯的炎癥反應，組①、②、③、④均可見有新生組織形成，組⑤未見新生組織形成。大體觀，組③、①可見明顯有黃色脂肪顆粒型成，組②、④未見明顯黃色脂肪脂肪顆粒，利用Masson三色染色染色

7、法可見①、②、③、④四個組中均可見脂肪細胞，及膠原蛋白，其中ADSCs+游離脂肪顆粒組中富含膠原及脂肪顆粒，且脂肪顆粒及膠原結(jié)締組織排列較規(guī)則，脂肪顆粒細胞大小不均勻，有新生脂肪顆粒細胞。單純ADSCs移植入組可見大量的膠原形成，無明顯成熟的脂肪顆粒細胞，排列紊亂，無明顯規(guī)律。透明質(zhì)酸+ADSCs組與單純ADSCs組接近，富含膠原蛋白排列有序，未見明顯成熟脂肪細胞，單純游離脂肪顆粒移植入組可見大量脂肪細胞形成，排列規(guī)律，大小均勻，膠原蛋

8、白形成相對較少。四組中體積組①＞組③＞組④＞組②，質(zhì)量組①＞組③=組④＞組②，組③與組④之間質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義。RT-PCR示四組中均見到人類mRNA表達，提示新生組織來自植入的復合組織。Westernblot示四組中均可見Ⅰ型膠原蛋白表達，其含量有組②≈組④＞組①＞組③的趨勢。
　　 4、結(jié)論：
　　 ADSCs其表面抗原較弱，不易產(chǎn)生抗原，不產(chǎn)生致熱源，局部注射產(chǎn)生炎癥反應較輕，注射局部無明顯炎癥反應。ADSCs可