組織工程化氣管構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
　　 目的本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，從骨髓中分離、純化、鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，研究其體外培養(yǎng)的增殖和生長特性，探討為組織工程化氣管的構(gòu)建提供種子細(xì)胞的可能性。
　　 方法：收集成人骨髓血，采用密度梯度離心和貼壁生長的方法分離并提取單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)；收集P2～P4代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞抗原表達(dá)；計(jì)數(shù)并繪制細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長曲線。
　　 結(jié)果：通

2、過密度梯度離心和貼壁生長的方法可以獲取具有一定形態(tài)特點(diǎn)、貼壁生長、增殖活躍的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；該細(xì)胞可表達(dá)CD29，CD44，CD105，不表達(dá)CD54，CD45；原代培養(yǎng)曲線顯示，第2d～6d為生長的潛伏期，第7～9d進(jìn)入對數(shù)生長期，10d后進(jìn)入平臺期；傳代培養(yǎng)的潛伏期為24h～36h，4d-5d后進(jìn)入對數(shù)增長期，9d左右進(jìn)入平臺期。在對數(shù)生長期，細(xì)胞倍增時(shí)間約為48h，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞在P9～P10出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：

3、1、利用密度梯度離心和貼壁的方法可以有效地分離、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；
　　 2、在適當(dāng)?shù)臈l件下，BMMSCs在體外表現(xiàn)出旺盛的增殖能力，可滿足組織工程學(xué)種子細(xì)胞的需要
　　 3、BMMSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD105，不表達(dá)CD34、CD45。
　　 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為呼吸道上皮樣細(xì)胞
　　 目的本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向呼吸道上皮樣細(xì)胞的分化并進(jìn)行形態(tài)學(xué)的初步鑒

4、定，探討為組織工程氣管提供呼吸道上皮種子細(xì)胞的可能性。
　　 方法：取p2～P4代生長狀態(tài)良好的BMMSCs細(xì)胞，用含有家兔氣管粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)容物的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，對誘導(dǎo)、分化的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。
　　 結(jié)果： BMMSCs細(xì)胞在含有家兔氣管粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)容物的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，經(jīng)過3d時(shí)間，細(xì)胞形態(tài)由長梭形變成多角形，HE染色可見吞飲小泡。
　　 結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)可以向氣管粘膜上皮樣細(xì)胞分

5、化。
　　 第三部分戊二醛與環(huán)氧化合物對交聯(lián)制備家兔氣管體外性能的比較研究
　　 目的采用戊二醛和環(huán)氧化合物交聯(lián)制備家兔氣管，評價(jià)家兔氣管的生物學(xué)性能，探討環(huán)氧化合物作為新型制備技術(shù)的可行性。
　　 方法：新鮮家兔氣管12根，隨機(jī)分為戊二醛組處理組（GA組，n=4）、環(huán)氧化合物處理組（PC組，n=4）及新鮮對照組（Fresh組，n=4）。測量各組處理前后的顏色、彈性、管壁厚度的變化。測量并計(jì)算各組處理前后的組織含

6、水量，交聯(lián)固定指數(shù)以評價(jià)交聯(lián)特點(diǎn)。通過觀察組織斷裂強(qiáng)度和斷裂延伸率評價(jià)其機(jī)械性能。采用膠原醢隆解并涮量隆解后的斷裂強(qiáng)度以分析組織穩(wěn)家性。誦討氣管與BMMSCs共培養(yǎng)、不同濃度交聯(lián)制備劑對BMMSC存活率的影響這兩種方法評價(jià)戊二醛和環(huán)氧化合物對交聯(lián)制備家兔氣管產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。
　　 結(jié)果： PC組外觀顏色、管壁彈性、管腔變化更接近天然氣管：PC組和GA組的機(jī)械強(qiáng)度相當(dāng)，均明顯高于Fresh組，Pc組斷裂延伸率大于GA組，且兩組均低

7、于Fresh組；PC組和GA組固定100小時(shí)的固定指數(shù)相當(dāng)；體外Ⅱ型膠原酶的降解結(jié)果顯示，Pc組和GA組的組織穩(wěn)定性均高于Fresh組，GA組和PC組之間沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；根據(jù)與處理后氣管共培養(yǎng)的BMMSCs細(xì)胞生長情況所得曲線顯示，PC組細(xì)胞可繼續(xù)穩(wěn)定增長，GA組細(xì)胞3d內(nèi)迅速死亡；原有濃度的PC和GA交聯(lián)制備劑對細(xì)胞均有很強(qiáng)的毒性，處理后不超過15％的細(xì)胞能夠存活，稀釋8倍以后，可以有超過70％的細(xì)胞存活。
　　 結(jié)論：1