釀酒酵母氧化應激反應中一組氧化還原酶的結構和功能研究.pdf

1、活性氧(reactive oxygen speices，ROS)是由細胞正常的有氧代謝產生或因暴露于誘導自由基產生的化合物，如超氧陰離子(·O<,2><'->)、過氧化氫(H<,2>O<,2>)及羥自由基(·OH)。當這些物質積累到一定的濃度時，就會導致細胞內大分子物質(脂質、蛋白質、DNA)發(fā)生氧化變性、交聯(lián)或斷裂，從而引起細胞結構和功能的破壞，甚至造成細胞的死亡。釀酒酵母擁有酶系和非酶系抗氧化系統(tǒng)來清除細胞內的自由基，并維持細胞內正

2、常的還原狀態(tài)。其中還原過氧化氫的最主要的兩個途徑分別為谷氧還蛋白系統(tǒng)(NADPH-Glr1-GSH-Grx)和硫氧還蛋白系統(tǒng)(NADPH-Trr1/2-Trx-Prx)。我們分別表達純化了這兩個系統(tǒng)中的部分蛋白，并通過蛋白質晶體學和體外生化實驗來研究其結構和功能上的相互關系，從而幫助我們構建氧化應激條件下蛋白之間相互作用網(wǎng)絡。 我們解析了釀酒酵母谷胱甘肽還原酶Glr1的氧化態(tài)的晶體結構。通過對大腸桿菌、人和酵母谷胱甘肽還原酶同源

3、結構的分析發(fā)現(xiàn)，三者皆為同二聚體，整體結構比較一致，且活性位點殘基高度保守，但在二聚體相互作用界面上存在著較大的差異。Glr1蛋白表面的半胱氨酸Cys239被谷胱甘肽修飾(glutathionylation)。盡管這一修飾并沒有對局部結構造成影響，但是Cys239位于底物GSSG進入通道的附近，這里同時也是其還原產物GSH的離開通道；同時谷胱甘肽化也是蛋白保護自由巰基或調節(jié)酶活的方式之一，因此這一位置的谷胱甘肽化對于蛋白活性的維持可能有

4、一定的作用。同時，我們發(fā)現(xiàn)Glr1中位于電子供體NADPH進入位點附近的Asn278被糖基化修飾，形成約20個糖基的寡糖鏈。我們通過體外酶活實驗鑒定了重組表達蛋白和天然蛋白的酶學動力學參數(shù)，確定了Asn278的糖基化降低了蛋白的催化活性。 對釀酒酵母谷氧還蛋白Grxl氧化型和谷胱甘肽化型結構的分析表明，伴隨Cys27和Cys30之間二硫鍵的斷裂，活性位點CPYC附近的殘基發(fā)生了較大的構象變化。同時我們根據(jù)谷胱甘肽化的Grx1的結

5、構揭示了其GSH結合相關的重要氨基酸殘基以及它們在穩(wěn)定結合的谷胱甘肽分子中所起到的作用。釀酒酵母Grx1和Grx2雖然同屬于雙巰基谷氧還蛋白亞家族，其活性位點同為CPYC，兩者之間的氨基酸序列一致性也高達64％，但是兩者在各自缺陷菌株的現(xiàn)象卻各不相同。通過Grx2氧化型和還原型兩種晶體結構，我們發(fā)現(xiàn)Grx2由于氧化還原狀態(tài)的不同所導致的構象變化與Grx1中發(fā)現(xiàn)的構象變化相類似。而在對Grx1谷胱甘肽化型結構和Grx2還原型結構的比較中我

6、們發(fā)現(xiàn)，位于谷胱甘肽結合位點的γ-谷氨酸一端與Grx1的Asp89之間形成較強的相互作用，而在Grx2中相應的位點變成Ser123，導致γ-谷氨酸一端與Grx2之間相互作用的削弱，從而降低GSH的結合能力，并進一步通過ITC實驗證明Grx1對GSH的親和力要明顯高于Grx2。Grx1位于細胞質和細胞核，而Grx2位于細胞質和線粒體中。不同的細胞定位存在這不同的氧化還原環(huán)境，尤其是GSH的濃度上的差異。而正是Grx1和Grx2對于GSH的

7、親和力的不同，導致了兩者在細胞中生理作用的差異。我們還解析了釀酒酵母烷基過氧化物還原酶Ahp1氧化型的晶體結構，發(fā)現(xiàn)其在一個非對稱單位中以同二聚體的形式存在，并形成了Cys31和另一個亞基中Cys62形成分子間的二硫鍵，同時其二聚體相互作用界面垂直于中心的β-sheet。但之前的文獻報道稱Ahp1在催化反應中應形成了Cys62與另一個亞基的Cys120的分子間二硫鍵，這與我們解析的晶體結構中的結果相沖突。于是我們進一步構建了Ahp1的C

8、31S，C62S和C120S三個突變體，并檢測其分子間二硫鍵的形成以及體外生化活性，并證實了我們的結果，即具催化活性半胱氨酸殘基為Cys31和Cys62，而非Cys120。 文獻報道Ahp1被泛素相關修飾蛋白Urm1共價修飾。由于Ahp1在氧化應激反應中在還原細胞內的過氧化物中起到重要的作用，這表明Urm1修飾體系在氧化應激中可能起到一定的調控作用。為此我們解析了Urm1的晶體結構，發(fā)現(xiàn)其整體結構與其溶液結構基本一致，不同在于其