擬南芥維生素K環(huán)氧化物還原酶的亞細(xì)胞定位和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)研究.pdf

1、擬南芥基因組和水稻基因組測序工作的完成，全面揭開了植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的序幕。全景式的蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用以及蛋白質(zhì)的動態(tài)變化等成為生物學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)。其中，蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位研究對于系統(tǒng)地理解植物形態(tài)建成、生長發(fā)育甚至逆境耐性等都是必不可少的環(huán)節(jié)，也是功能基因組學(xué)的重要內(nèi)容。另外，蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的研究是了解蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)和功能的重要途徑。維生素K環(huán)氧化物還原酶（VKOR）是一種存在于人類和哺乳動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜

2、蛋白，人們對于VKOR及其同源蛋白的研究主要集中在哺乳動物以及原核生物中，而對植物VKOR同源物的研究幾乎是一片空白。因此，我們選取擬南芥VKOR作為研究對象對高等植物的VKOR的定位與結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究。本研究通過生物信息學(xué)軟件的應(yīng)用，預(yù)測擬南芥VKOR的亞細(xì)胞定位以及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，通過GFP融合蛋白瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其亞細(xì)胞定位，并利用堿性磷酸酶融合手段分析該蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，具體結(jié)果如下：
　　 （1)VKOR編碼蛋白的亞細(xì)胞定位及

3、信號肽預(yù)測。根據(jù)NCBI發(fā)布的擬南芥VKOR的基因，At4g35760，利用TargetP、PredSL、BaCello、SLPFA、SLP-Local和ChloroP等在線程序預(yù)測該基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位，綜合各種預(yù)測結(jié)果表明該蛋白很可能定位于葉綠體，而且編碼蛋白的N末端有一段45個氨基酸長度的的葉綠體信號肽。
　　 （2）GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建。設(shè)計特異性引物從擬南芥cDNA文庫中克隆得到擬南芥VKOR的基因，并以此為模

4、板擴(kuò)增信號肽序列（Transit Peptide，TP），插入到植物表達(dá)載體pJIT163-gfp的綠色熒光蛋白基因gfp序列N端，構(gòu)建GFP融合表達(dá)載體pJIT163-TP-gfp。
　　 （3）利用原生質(zhì)體瞬時表達(dá)技術(shù)，確定擬南芥VKOR的亞細(xì)胞定位。利用PEG介導(dǎo)法將pJIT163-TP-gfp和pJIT163-gfp質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體,23℃培養(yǎng)12-16小時，激光共聚焦顯微鏡觀察原生質(zhì)體。以pJIT163-gf

5、p作為陰性對照，其表達(dá)的GFP蛋白發(fā)出的綠色熒光分布于細(xì)胞質(zhì)中；而pJIT163-TP-gfp表達(dá)的TP-GFP融合蛋白的綠色熒光與葉綠體的自發(fā)紅色熒光重合，結(jié)果表明，VKOR定位于擬南芥葉綠體中，其信號肽是從N端起始的前45個氨基酸。
　　 （4)VKOR蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測。根據(jù)擬南芥VKOR的氨基酸序列，利用TMHMM、HMM-TM、TMPred、TOPCONS、SOSUI、PHILIUS、PolyPhobius、HMMTO

6、P和THUMUP等在線程序預(yù)測擬南芥VKOR的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，完整的VKOR蛋白包含2個結(jié)構(gòu)域，膜結(jié)構(gòu)域（AtVKOR）和硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域（AtDsbA），其中AtVKOR結(jié)構(gòu)域可能包含4-5個跨膜區(qū)。
　　 （5）利用堿性磷酸酶融合技術(shù)研究VKOR的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。膜蛋白與堿性磷酸酶融合后，根據(jù)堿性磷酸酶活性的變化可以指示膜蛋白面向膜的內(nèi)側(cè)或外側(cè)。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，設(shè)計各特異性引物，分別PCR擴(kuò)增VKOR各跨膜區(qū)之前

7、的序列，即從N端至不同跨膜區(qū)位點(diǎn)，將擴(kuò)增的各片段插入到原核表達(dá)載體pDHB7744的堿性磷酸酶基因序列的N末端，構(gòu)建5個VKOR片段與堿性磷酸酶的融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測定堿性磷酸酶活性，研究VKOR蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。
　　 （6）利用改良的堿性磷酸酶融合技術(shù)確定VKOR蛋白在葉綠體中的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。由于堿性磷酸酶融合技術(shù)表達(dá)的酶活性不夠規(guī)律，為了確定VKOR的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，我們利用改良的堿性磷酸酶融合技術(shù)即“三明治”（膜蛋白-堿性磷

8、酸酶-膜蛋白）技術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。PCR擴(kuò)增每個融合片段的各剩余的VKOR片段序列，利用上述構(gòu)建的堿性磷酸酶的融合表達(dá)載體，插入到各融合表達(dá)載體的AP序列的C末端，共構(gòu)建7個“三明治”融合表達(dá)載體。融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在含有誘導(dǎo)物IPTG以及堿性磷酸酶的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸（XP）的固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)2天，檢測各融合表達(dá)載體的堿性磷酸酶活性。其中有3個融合位點(diǎn)表現(xiàn)出高堿性磷酸酶活性,4個融合位點(diǎn)處活性很低，根