短指（趾）和缺指（趾）畸形的分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、新生兒中四肢先天畸形的發(fā)生率為1/500到1/1000。單獨發(fā)生的四肢畸形一般不會危及患者生命，但是嚴重影響其生活質(zhì)量。近年各種遺傳性肢端骨骼畸形的致病基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，鑒定這些基因并研究其致病機制，可以為這些疾病的遺傳咨詢奠定基礎(chǔ)，可以豐富發(fā)育生物學(xué)的知識，從而為更多種遺傳性或非遺傳性骨骼疾病的預(yù)防和治療提供靶點。本文研究集中于常染色體顯性遺傳的肢端骨骼縮短或缺失畸形，包括短指(趾)畸形和缺指(趾)畸形。研究對象為5個表型不同但發(fā)生機制

2、相關(guān)的中國人家系。研究工作分兩部分。 第一部分短指(趾)畸形相關(guān)致病基因突變的研究短指(趾)畸形(Brachydactyly，BD)是指(趾)骨、掌(跖)骨發(fā)育異常導(dǎo)致的指(趾)縮短畸形。本文首先對以中節(jié)指骨縮短為共同表現(xiàn)的三個中國人短指(趾)畸形家系進行了致病基因突變研究研究。 其中一個家系(家系2)主要表型為C型短指(趾)畸形(BDC)伴掌跖角化(palmoplantar keratoderma，PPK)。迄今為止，

3、國內(nèi)外未曾有過類似表型報道。患者2、3和5指中節(jié)指骨縮短，為BDC特征性表現(xiàn)。部分患者生后數(shù)月丌始出現(xiàn)雙側(cè)手掌及足底皮膚彌散的黃色增厚斑塊。我們分別針對BDC和BDAl的致病基因IHH和GDF5設(shè)計PCR引物，擴增全部外顯子和外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)，對患者基因組DNA測序。結(jié)果在患者中均發(fā)現(xiàn)GDF5基因新突變c.146lT>G(p.Y487X)，在家系正常成員及50名無關(guān)正常個體中均未檢到該突變。因此，該無義突變是BDC患者中的致病突變。

4、根據(jù)我們目前掌握的家系資料不能確定該家系中全部BDC患者都伴發(fā)PPK，加之又無GDF5基因與皮膚發(fā)育或生理相關(guān)的文獻報道，因此尚不能確定新發(fā)現(xiàn)的GDF5基因突變也是導(dǎo)致患者發(fā)生PPK的遺傳基礎(chǔ)。為了進一步檢測GDF5基因新突變對蛋白加工分泌的影響及其與PPK發(fā)生的關(guān)系，我們通過基因轉(zhuǎn)染實驗進行了初步功能研究。將正常野生型及突變型的GDF5基因克隆并引入c-myc標簽序列，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)感染永生化皮膚角質(zhì)形成細胞HaCat，建立穩(wěn)

5、定整合細胞系。應(yīng)用抗c.myc抗體對培養(yǎng)細胞裂解物和培養(yǎng)上清進行Western印跡檢測，證實突變蛋白不能像野生型蛋白那樣分泌到細胞外；通過RT-PCR對培養(yǎng)細胞的角質(zhì)形成細胞分化標記基因IVL和KRT10進行mRNA表達檢測，發(fā)現(xiàn)在整合野生型和突變型GDF5基因的細胞中表達水平均降低，突變基因表達引起的降低更顯著。因此，GDF5基因發(fā)生c.146lT>G(p.Y487X)突變，和已報道的突變一樣通過蛋白滯留在細胞內(nèi)這一機制導(dǎo)致BDC發(fā)生

6、。同時，突變GDF5基因表達可能干擾角質(zhì)形成細胞分化，進而導(dǎo)致PPK。GDF5基因c.1461T>G(p.Y487X)突變與PPK發(fā)生相關(guān)的明確結(jié)論有待進一步的實驗來驗證。 另一個家系(家系1)為典型B型短指(趾)畸形(BDB)。國外在BDB患者中發(fā)現(xiàn)的ROR2基因致病突變集中于第8和第9外顯子，國內(nèi)雖有家系報道但無ROR2基因突變研究。我們針對ROR2基因內(nèi)已知致BDB的突變區(qū)域設(shè)計引物，PCR擴增患者基因組DNA中目的片段，

7、并將PCR產(chǎn)物片段直接測序及克隆至T載體測序，進行致病突變檢測。結(jié)果顯示，患者攜帶一個雜合移碼突變c.1398-1399insA(P.R467fsX523)。該突變是國外已報道過的BDB家系致病突變。C.1398-1399 insA(p.R467fsX523)可能是BDB中一種頻發(fā)的致病突變。 第三個家系是SYM1。迄今為止，國內(nèi)尚無中國人SYM1家系文獻報道。該家系中患者除中節(jié)指骨縮短外，還表現(xiàn)第1掌骨縮短，第5指遠節(jié)指骨縮短

8、且指甲發(fā)育不良，絕大多數(shù)近端指骨間關(guān)節(jié)及多數(shù)遠端指骨間關(guān)節(jié)骨性融合，多處跗骨間關(guān)節(jié)骨性融合；另外患者聽力差，中耳檢查見鼓膜異常。我們選擇BDA1、BDB和BDC的致病基因附近微衛(wèi)星標記進行家系成員基因型和連鎖分析，同時在患者中進行以上三個致病基因全部或部分外顯子測序分析，均未發(fā)現(xiàn)支持BDA1、BDB和BDC的遺傳證據(jù)。進一步對編碼noggin蛋白的NOG基因進行測序分析，發(fā)現(xiàn)患者均具有一個錯義突變c.142G>A(p.E48K)。在家系

9、正常成員及50名無關(guān)正常個體中未檢到該突變；NOG基因第48位密碼子編碼的谷氨酸從魚到人都高度一致，p.E48K突變氨基酸極性變化顯著。因此，該突變應(yīng)該是SYM1的致病突變。此外，在一名SYM1伴卵巢功能早衰(premature ovarianfailure，POF)的R本患者中，曾有人發(fā)現(xiàn)該突變。我們的發(fā)現(xiàn)不僅明確了c.142G>A(p.E48K)的致病突變性質(zhì)，同時還提示該突變可能在亞洲人SYM1中多見。 總之，本部分研究了

10、三個中國人短指(趾)相關(guān)畸形家系中致病基因的結(jié)構(gòu)和功能異常。其中在一個家系中發(fā)現(xiàn)的BDC伴掌跖角化的表型組合及GDF5基因c.1461T>G(p.Y487X)無義突變都是國際首次。對野生型和突變GDF5基因進行功能研究，首次發(fā)現(xiàn)GDF5基因表達抑制皮膚角質(zhì)形成細胞分化標記基因表達，并且突變基因抑制更顯著。另外兩個家系中發(fā)現(xiàn)的致病突變在國外已有報道，為中國人相關(guān)致病突變研究的首報。 第二部分缺指(趾)畸形致病突變的鑒定缺指(趾)/

11、手足裂畸形(ectrodactyly/split-hand/split-foot malformation，SHFM)是一種嚴重影響患者精細活動的先天性肢端畸形，是四肢端骨(autopod)中部指軸發(fā)育不全而剩余指(趾)呈不同模式的融合，典型表現(xiàn)即所謂龍蝦爪(中部指軸缺陷)、或獨指(橈側(cè)指軸缺陷而無裂隙，第5指[趾]總不受累)。SHFM可以單獨發(fā)生，或者伴隨其它四肢骨骼畸形，或者伴隨并非四肢骨的其它器官發(fā)育異常。其遺傳方式有多種，已報道

12、過的有典型的常染色體顯性遺傳、不規(guī)律的常染色體顯性遺傳(表現(xiàn)為外顯率降低、表現(xiàn)度變異)、常染色體隱性遺傳和X染色體遺傳等。絕大多數(shù)單獨發(fā)生的SHFM呈幾乎完全外顯的典型常染色體顯性遺傳傳遞。目前已定位的人類SHFM遺傳位點包括：SHFM1(MIM 183600)、SItFM2(MIM 313350)、SHFM3(MIM 600095)、SHFM4(MIM 605289)和SHFM5(MIM 606708)，分別位于人染色體7q21、Xq

13、26、10q24、3q27和2q31。因此，SHFM也是一種表現(xiàn)臨床和遺傳異質(zhì)性的先天性肢端畸形。SHFM3和SHFM4位點上的致病突變已經(jīng)明確，分別是染色體10q24區(qū)域內(nèi)約0.5Mb的DNA串聯(lián)重復(fù)和染色體3q27區(qū)域內(nèi)TP63(OMIM 603273，亦稱p63、TP73L等)基因的點突變。國內(nèi)外尚無在中國人SHFM家系發(fā)現(xiàn)致病突變的報道。 在本部分研究中，我們利用收集到的兩個中國人SHFM家系進行了遺傳位點和致病突變研究

14、。首先對家系中患者進行了臨床體檢，拍攝畸形部位外觀照片及x光照片。進一步的實驗研究工作包括：對家系成員外周血細胞進行高分辨染色體G顯帶分析；對SHFM4位點處TP63基因全部外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)設(shè)計并合成引物，以患者基因組DNA為模板進行PCR擴增和產(chǎn)物直接測序；在已知的5個SHFM位點染色體區(qū)域選擇微衛(wèi)星標記，通過PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析家系成員的基因型和單體型：對家系中患者進行染色體10q24.3區(qū)域SHFM3位點

15、內(nèi)微衛(wèi)星標記多態(tài)片段的測序分析，比較患者和基因型相同的正常對照個體不同等位片段測序峰高度的差別，借以檢測DNA重復(fù)。 兩個SHFM家系患者的缺指(趾)表型及傳遞規(guī)律有所不同。一個家系(家系4)患者呈典型而嚴重的手足裂畸形(手為獨指畸形，足為龍蝦爪畸形)，患者表型相似，并呈典型的常染色體顯性遺傳。另一家系(家系5)患者表型輕重不一，重者呈典型龍蝦爪樣畸形，輕者只有膜性并指或個別指骨缺失；該家系中患者畸形足重于手，均有手或足的第一指

16、(趾)的寬大或復(fù)制畸形；雖為常染色體顯性遺傳方式，但有表現(xiàn)度變異。高分辨染色體G顯帶分析結(jié)果顯示：兩個家系患者均未見染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)畸變；對TP63基因進行測序亦都未發(fā)現(xiàn)突變。微衛(wèi)星標記基因型分析結(jié)果提示表型典型的家系中致病突變可能位于SHFM2或SHFM3位點。與正常個體相比，該家系全部患者都在SHFM3位點微衛(wèi)星多態(tài)標記表現(xiàn)患者共享等位片段信號明顯增強，患者測序圖中該等位片段峰高明顯增加。這一現(xiàn)象表明患者發(fā)生SHFM3位點內(nèi)的D

17、NA重復(fù)突變。在另一存在表現(xiàn)度變異的家系中，微衛(wèi)星標記分析數(shù)據(jù)排除了其致病突變與SHFM2-SHFM5四個位點連鎖的可能；而染色體7q21區(qū)域S}tFM1位點內(nèi)有兩個標記在0=0時，得到最大LOD值1.51，提示該家系致病突變可能位于該位點。 綜上所述，我們首次在中國人SHFM家系患者中對五個SHFM位點進行了微衛(wèi)星標記基因型分析，以及SHFM3位點內(nèi)微衛(wèi)星標記測序.半定量分析。在一個SHFM家系中確定致病突變?yōu)槿旧w10q24