短指（趾）和缺指（趾）畸形的分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、新生兒中四肢先天畸形的發(fā)生率為1/500到1/1000。單獨(dú)發(fā)生的四肢畸形一般不會(huì)危及患者生命，但是嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。近年各種遺傳性肢端骨骼畸形的致病基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，鑒定這些基因并研究其致病機(jī)制，可以為這些疾病的遺傳咨詢奠定基礎(chǔ)，可以豐富發(fā)育生物學(xué)的知識(shí)，從而為更多種遺傳性或非遺傳性骨骼疾病的預(yù)防和治療提供靶點(diǎn)。本文研究集中于常染色體顯性遺傳的肢端骨骼縮短或缺失畸形，包括短指(趾)畸形和缺指(趾)畸形。研究對(duì)象為5個(gè)表型不同但發(fā)生機(jī)制

2、相關(guān)的中國(guó)人家系。研究工作分兩部分。 第一部分短指(趾)畸形相關(guān)致病基因突變的研究短指(趾)畸形(Brachydactyly，BD)是指(趾)骨、掌(跖)骨發(fā)育異常導(dǎo)致的指(趾)縮短畸形。本文首先對(duì)以中節(jié)指骨縮短為共同表現(xiàn)的三個(gè)中國(guó)人短指(趾)畸形家系進(jìn)行了致病基因突變研究研究。 其中一個(gè)家系(家系2)主要表型為C型短指(趾)畸形(BDC)伴掌跖角化(palmoplantar keratoderma，PPK)。迄今為止，

3、國(guó)內(nèi)外未曾有過(guò)類似表型報(bào)道?；颊?、3和5指中節(jié)指骨縮短，為BDC特征性表現(xiàn)。部分患者生后數(shù)月丌始出現(xiàn)雙側(cè)手掌及足底皮膚彌散的黃色增厚斑塊。我們分別針對(duì)BDC和BDAl的致病基因IHH和GDF5設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增全部外顯子和外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)，對(duì)患者基因組DNA測(cè)序。結(jié)果在患者中均發(fā)現(xiàn)GDF5基因新突變c.146lT>G(p.Y487X)，在家系正常成員及50名無(wú)關(guān)正常個(gè)體中均未檢到該突變。因此，該無(wú)義突變是BDC患者中的致病突變。

4、根據(jù)我們目前掌握的家系資料不能確定該家系中全部BDC患者都伴發(fā)PPK，加之又無(wú)GDF5基因與皮膚發(fā)育或生理相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，因此尚不能確定新發(fā)現(xiàn)的GDF5基因突變也是導(dǎo)致患者發(fā)生PPK的遺傳基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步檢測(cè)GDF5基因新突變對(duì)蛋白加工分泌的影響及其與PPK發(fā)生的關(guān)系，我們通過(guò)基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步功能研究。將正常野生型及突變型的GDF5基因克隆并引入c-myc標(biāo)簽序列，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)感染永生化皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCat，建立穩(wěn)

5、定整合細(xì)胞系。應(yīng)用抗c.myc抗體對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)上清進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，證實(shí)突變蛋白不能像野生型蛋白那樣分泌到細(xì)胞外；通過(guò)RT-PCR對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)記基因IVL和KRT10進(jìn)行mRNA表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在整合野生型和突變型GDF5基因的細(xì)胞中表達(dá)水平均降低，突變基因表達(dá)引起的降低更顯著。因此，GDF5基因發(fā)生c.146lT>G(p.Y487X)突變，和已報(bào)道的突變一樣通過(guò)蛋白滯留在細(xì)胞內(nèi)這一機(jī)制導(dǎo)致BDC發(fā)生

6、。同時(shí)，突變GDF5基因表達(dá)可能干擾角質(zhì)形成細(xì)胞分化，進(jìn)而導(dǎo)致PPK。GDF5基因c.1461T>G(p.Y487X)突變與PPK發(fā)生相關(guān)的明確結(jié)論有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。 另一個(gè)家系(家系1)為典型B型短指(趾)畸形(BDB)。國(guó)外在BDB患者中發(fā)現(xiàn)的ROR2基因致病突變集中于第8和第9外顯子，國(guó)內(nèi)雖有家系報(bào)道但無(wú)ROR2基因突變研究。我們針對(duì)ROR2基因內(nèi)已知致BDB的突變區(qū)域設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增患者基因組DNA中目的片段，

7、并將PCR產(chǎn)物片段直接測(cè)序及克隆至T載體測(cè)序，進(jìn)行致病突變檢測(cè)。結(jié)果顯示，患者攜帶一個(gè)雜合移碼突變c.1398-1399insA(P.R467fsX523)。該突變是國(guó)外已報(bào)道過(guò)的BDB家系致病突變。C.1398-1399 insA(p.R467fsX523)可能是BDB中一種頻發(fā)的致病突變。 第三個(gè)家系是SYM1。迄今為止，國(guó)內(nèi)尚無(wú)中國(guó)人SYM1家系文獻(xiàn)報(bào)道。該家系中患者除中節(jié)指骨縮短外，還表現(xiàn)第1掌骨縮短，第5指遠(yuǎn)節(jié)指骨縮短

8、且指甲發(fā)育不良，絕大多數(shù)近端指骨間關(guān)節(jié)及多數(shù)遠(yuǎn)端指骨間關(guān)節(jié)骨性融合，多處跗骨間關(guān)節(jié)骨性融合；另外患者聽(tīng)力差，中耳檢查見(jiàn)鼓膜異常。我們選擇BDA1、BDB和BDC的致病基因附近微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行家系成員基因型和連鎖分析，同時(shí)在患者中進(jìn)行以上三個(gè)致病基因全部或部分外顯子測(cè)序分析，均未發(fā)現(xiàn)支持BDA1、BDB和BDC的遺傳證據(jù)。進(jìn)一步對(duì)編碼noggin蛋白的NOG基因進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)患者均具有一個(gè)錯(cuò)義突變c.142G>A(p.E48K)。在家系

9、正常成員及50名無(wú)關(guān)正常個(gè)體中未檢到該突變；NOG基因第48位密碼子編碼的谷氨酸從魚(yú)到人都高度一致，p.E48K突變氨基酸極性變化顯著。因此，該突變應(yīng)該是SYM1的致病突變。此外，在一名SYM1伴卵巢功能早衰(premature ovarianfailure，POF)的R本患者中，曾有人發(fā)現(xiàn)該突變。我們的發(fā)現(xiàn)不僅明確了c.142G>A(p.E48K)的致病突變性質(zhì)，同時(shí)還提示該突變可能在亞洲人SYM1中多見(jiàn)。 總之，本部分研究了

10、三個(gè)中國(guó)人短指(趾)相關(guān)畸形家系中致病基因的結(jié)構(gòu)和功能異常。其中在一個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)的BDC伴掌跖角化的表型組合及GDF5基因c.1461T>G(p.Y487X)無(wú)義突變都是國(guó)際首次。對(duì)野生型和突變GDF5基因進(jìn)行功能研究，首次發(fā)現(xiàn)GDF5基因表達(dá)抑制皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)記基因表達(dá)，并且突變基因抑制更顯著。另外兩個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)的致病突變?cè)趪?guó)外已有報(bào)道，為中國(guó)人相關(guān)致病突變研究的首報(bào)。 第二部分缺指(趾)畸形致病突變的鑒定缺指(趾)/

11、手足裂畸形(ectrodactyly/split-hand/split-foot malformation，SHFM)是一種嚴(yán)重影響患者精細(xì)活動(dòng)的先天性肢端畸形，是四肢端骨(autopod)中部指軸發(fā)育不全而剩余指(趾)呈不同模式的融合，典型表現(xiàn)即所謂龍蝦爪(中部指軸缺陷)、或獨(dú)指(橈側(cè)指軸缺陷而無(wú)裂隙，第5指[趾]總不受累)。SHFM可以單獨(dú)發(fā)生，或者伴隨其它四肢骨骼畸形，或者伴隨并非四肢骨的其它器官發(fā)育異常。其遺傳方式有多種，已報(bào)道

12、過(guò)的有典型的常染色體顯性遺傳、不規(guī)律的常染色體顯性遺傳(表現(xiàn)為外顯率降低、表現(xiàn)度變異)、常染色體隱性遺傳和X染色體遺傳等。絕大多數(shù)單獨(dú)發(fā)生的SHFM呈幾乎完全外顯的典型常染色體顯性遺傳傳遞。目前已定位的人類SHFM遺傳位點(diǎn)包括：SHFM1(MIM 183600)、SItFM2(MIM 313350)、SHFM3(MIM 600095)、SHFM4(MIM 605289)和SHFM5(MIM 606708)，分別位于人染色體7q21、Xq

13、26、10q24、3q27和2q31。因此，SHFM也是一種表現(xiàn)臨床和遺傳異質(zhì)性的先天性肢端畸形。SHFM3和SHFM4位點(diǎn)上的致病突變已經(jīng)明確，分別是染色體10q24區(qū)域內(nèi)約0.5Mb的DNA串聯(lián)重復(fù)和染色體3q27區(qū)域內(nèi)TP63(OMIM 603273，亦稱p63、TP73L等)基因的點(diǎn)突變。國(guó)內(nèi)外尚無(wú)在中國(guó)人SHFM家系發(fā)現(xiàn)致病突變的報(bào)道。 在本部分研究中，我們利用收集到的兩個(gè)中國(guó)人SHFM家系進(jìn)行了遺傳位點(diǎn)和致病突變研究

14、。首先對(duì)家系中患者進(jìn)行了臨床體檢，拍攝畸形部位外觀照片及x光照片。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究工作包括：對(duì)家系成員外周血細(xì)胞進(jìn)行高分辨染色體G顯帶分析；對(duì)SHFM4位點(diǎn)處TP63基因全部外顯子及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)設(shè)計(jì)并合成引物，以患者基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物直接測(cè)序；在已知的5個(gè)SHFM位點(diǎn)染色體區(qū)域選擇微衛(wèi)星標(biāo)記，通過(guò)PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析家系成員的基因型和單體型：對(duì)家系中患者進(jìn)行染色體10q24.3區(qū)域SHFM3位點(diǎn)

15、內(nèi)微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)片段的測(cè)序分析，比較患者和基因型相同的正常對(duì)照個(gè)體不同等位片段測(cè)序峰高度的差別，借以檢測(cè)DNA重復(fù)。 兩個(gè)SHFM家系患者的缺指(趾)表型及傳遞規(guī)律有所不同。一個(gè)家系(家系4)患者呈典型而嚴(yán)重的手足裂畸形(手為獨(dú)指畸形，足為龍蝦爪畸形)，患者表型相似，并呈典型的常染色體顯性遺傳。另一家系(家系5)患者表型輕重不一，重者呈典型龍蝦爪樣畸形，輕者只有膜性并指或個(gè)別指骨缺失；該家系中患者畸形足重于手，均有手或足的第一指

16、(趾)的寬大或復(fù)制畸形；雖為常染色體顯性遺傳方式，但有表現(xiàn)度變異。高分辨染色體G顯帶分析結(jié)果顯示：兩個(gè)家系患者均未見(jiàn)染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)畸變；對(duì)TP63基因進(jìn)行測(cè)序亦都未發(fā)現(xiàn)突變。微衛(wèi)星標(biāo)記基因型分析結(jié)果提示表型典型的家系中致病突變可能位于SHFM2或SHFM3位點(diǎn)。與正常個(gè)體相比，該家系全部患者都在SHFM3位點(diǎn)微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記表現(xiàn)患者共享等位片段信號(hào)明顯增強(qiáng)，患者測(cè)序圖中該等位片段峰高明顯增加。這一現(xiàn)象表明患者發(fā)生SHFM3位點(diǎn)內(nèi)的D

17、NA重復(fù)突變。在另一存在表現(xiàn)度變異的家系中，微衛(wèi)星標(biāo)記分析數(shù)據(jù)排除了其致病突變與SHFM2-SHFM5四個(gè)位點(diǎn)連鎖的可能；而染色體7q21區(qū)域S}tFM1位點(diǎn)內(nèi)有兩個(gè)標(biāo)記在0=0時(shí)，得到最大LOD值1.51，提示該家系致病突變可能位于該位點(diǎn)。 綜上所述，我們首次在中國(guó)人SHFM家系患者中對(duì)五個(gè)SHFM位點(diǎn)進(jìn)行了微衛(wèi)星標(biāo)記基因型分析，以及SHFM3位點(diǎn)內(nèi)微衛(wèi)星標(biāo)記測(cè)序.半定量分析。在一個(gè)SHFM家系中確定致病突變?yōu)槿旧w10q24