復雜多并指(趾)畸形遺傳定位及致病突變分析視網膜母細胞瘤中RB1基因致病突變檢測.pdf

1、非綜合征型并指(趾)畸形是人類最常見的肢端畸形，多呈常染色體顯性遺傳。Temtamy與McKusick按臨床表現將非綜合征型并指(趾)分為五型。其中Ⅳ型并指(syndactyly type Ⅳ，SD4；MIM186200)又稱Haas型并指，主要表現為雙側完全性皮膚并指，多伴有第6根掌骨及手指多指現象，常常由于筋腱攣縮整個手呈杯狀結構，但不存在骨性融合；通常下肢受累較輕，偶見伴發(fā)脛側半肢畸形。三節(jié)指節(jié)拇指——多并指綜合征(triphal

2、angeal thumb-Polysyndactyly syndrome，TPTPs；MIM174500)是一種呈常染色體顯性遺傳的肢端畸形，表現為在第1指即大拇指的位置出現一個或多個具有三節(jié)指節(jié)的類似大拇指結構，同時存在第3—5指全并指或第4—5指并指，而第2指往往受累較輕；通常下肢受累較輕。 在胚胎早期肢端發(fā)育過程中，極化活性區(qū)(zone of polarizing activity，ZPA)分泌的Shh蛋白決定了指趾數目及

3、形態(tài)，而人類SHH基因位于染色體7q36區(qū)域。人類染色體7q36區(qū)域與肢端發(fā)育密切相關，目前定位于此的肢端畸形有：軸前多指/三節(jié)指節(jié)拇指(preaxial polydactyly/triphalangeal thumb，PPD/TPT；MIM174500)，TPTPS，SD4及脛側半肢—多并指—三指節(jié)拇指綜合征(tibial hemimelia-Polysyndactyly-Triphalangeal thumbs syndrome，T

4、HPTTS；MIM188770)，無手足畸形(acheiropodia，ACHR；MIM200500)，肢胸綜合征(acropectoral syndrome，ACRPS；MIM605967)。其中PPD/TPT，TPTPS及THPTTS都存在三指節(jié)拇指的表型。有趣的是，1999年，Heus等人將PPD/TPT致病基因的關鍵區(qū)域縮小到450kb并排除了SHH基因。Lettice等通過比較基因組和轉基因動物的遺傳定位分析實驗發(fā)現，此區(qū)域內

5、Lmbr1/C7orf2(limb region 1)基因第5內含子中存在大約800bp的ZPA調控序列(ZPA regulatory sequence，ZRS)，在它控制下的LacZ報告基因在肢芽后緣ZPA區(qū)域有特異性表達。隨后，研究人員在8個人類PPD/TPT家系受累個體，3個PPD突變鼠模型及3個攜帶多趾表型的貓的ZRS內發(fā)現了不同的點突變，證實了ZRS作為SHH增強子在PPD/TPT中的致病作用。在一個泰國TPTPS家系中，TP

6、TPS表型患者、SD4伴脛側半肢畸形表型患者共存的事實提示，TPT、TPTPS、SD4和THPTTS可能有著相似的遺傳致病機制。 拷貝數變異(copy number variation，CNV)是指基因組中>1kb的DNA片段存在拷貝數目變化的現象，通常包括插入、缺失和重復。研究發(fā)現，CNV在基因組中普遍存在，與每300bp就可出現一次的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)相比，C

7、NV所涉及的DNA序列范圍更為廣泛，大概覆蓋12％的人類基因組的序列。CNV與人類疾病發(fā)生密切相關，當基因組中由于CNV的存在，引起一些劑量敏感基因發(fā)生缺失、重復或者結構完整性破壞時，就會導致基因組疾病(genomic disorder)的發(fā)生。 本研究以6個中國人TPTPS/SD4家系為對象，家系1的患者具有典型的TPTPS手部畸形，家系2、3、4、6中TPTPS/SD4表型并存，家系5表現為典型的SD4。針對7q36區(qū)域，在

8、4個家系中進行兩點連鎖分析，結果當θ=0時，在位于LMBR1基因內的遺傳標記TG處獲得最大累計LOD值為17.32，其中家系1為9.52，家系2為3，72，家系3為2.65，家系4為1.43，肯定連鎖。首次在中國人TPTPS/SD4家系中確認了TPTPS/SD4致病基因定位于染色體7q36。通過單倍型分析將TPTPS/SD4致病基因定位至微衛(wèi)星標記AGAA至AATT之間約647kb、不包含SHH基因的范圍內。 前期工作中，對TP

9、TPS/SD4連鎖區(qū)域內的候選基因及10個物種間高度保守的非編碼序列(包括ZRS)進行測序，結果沒有發(fā)現致病性序列改變。本研究中，通過回顧分析測序圖譜，發(fā)現患者當中位于高度保守非編碼區(qū)4內和ZRS內的兩個SNP(rs11976306，rs10254391)存在等位基因不平衡現象；對更多患者和家系內正常個體的測序結果顯示，該現象與疾病表型共分離，提示在該區(qū)域內可能存在與TPTPS/SD4相關的DNA拷貝數增加。通過實時定量PCR分析發(fā)現6

10、個TPTPS/SD4家系中都存在ZRS拷貝數增加，并應用熒光原位雜交技術直接在患者間期核中觀察到了該段DNA重復現象。Ssq小鼠的轉基因插入位點也存在包含鼠ZRS在內的24kb的DNA重復，進一步證明了ZRS拷貝數增加的致病性。 本研究在647kb的TPTPS/SD4連鎖范圍內，綜合運用實時定量PCR技術和Affymetrix SNP 6.0芯片，對家系1—6患者的重復突變斷端邊界進行了精細定位，并據此成功克隆了家系1、3和5的

11、斷裂接合片段。根據以上分析，家系1、3、5患者的重復突變范圍確定為：144859bp、216761bp和324189bp；而家系2、4、6患者的DNA最小重復范圍約為379kb、294kb和398kb。 分析家系1、3、5患者重復突變斷端區(qū)域基因組序列及結構特征，提出家系1患者重復突變的形成機制可能是非等位基因同源重組(nonallelic homologous recombination，NAHR)和非同源斷端連接機制(non

12、homologous end—joining，NHEJ)或復制叉停頓和模板轉位機制(fork stalling and template switching，FosTes)。家系3和家系5患者重復突變的形成機制可能是非同源斷端連接機制(nonhomologous end—joining，NHEJ)。 總之，本研究在6個中國人TPTPS/SD4家系中確認了TPTPS/SD4致病基因位于染色體7q36區(qū)域一個約647kb的區(qū)間內；發(fā)

13、現TPTPS/SD4致病突變是包含ZRS在內的DNA重復突變；患者表型嚴重程度與重復片段大小無直接關系；基于對本研究中6個TPTPS/SD4家系中患者表型的分析及分子遺傳學發(fā)現，結合文獻分析，提出PPD/TPT、TPTPS、SD4和THPTTS是一個連續(xù)的表型譜的概念。 RB1(Retinoblastoma 1，RB1；MIM 180200)基因突變是視網膜母細胞瘤發(fā)生中的起始基因缺陷。視網膜母細細胞瘤分遺傳性和非遺傳性兩種，幾

14、乎所有的雙側和家族性患者都是遺傳性視網膜母細胞瘤。只有15％的單側視網膜母細胞瘤患者是遺傳性的，其余都是非遺傳性的散發(fā)病例。遺傳性視網膜母細胞瘤患者攜帶生殖系RB1基因突變，RB1基因生殖系突變的檢測有助于遺傳性視網膜母細胞瘤患者的確認和其高危親屬中攜帶者的檢出，從而提供相應的遺傳咨詢。迄今，已發(fā)現了近600種來自不同種族背景的RB1基因突變，根據一項RB1基因突變的meta分析報告，來自中國人群的突變僅有22種。 本研究中，首

15、先應用變性高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography，DHPLC)或高分辨熔解曲線分析(High Resolution Melting，HRM)做為初篩工具，結合測序驗證，對31名中國漢族視網膜母細胞瘤患者進行了RB1基因外顯子及鄰近內含子區(qū)域的微小缺陷(micro—lesion)的突變篩查。對于在上述篩查中的陰性個體，進行了多重連接探針擴增分析(multiple ligation pro

16、be amplification，MLPA)，對RB1基因外顯子或包含整個RB1基因的拷貝數變異進行檢測。對基因組DNA水平上RB1基因突變檢測陰性個體，進行了轉錄本分析，檢測存在于內含子當中的剪接位點突變或大的重組造成的剪接改變。 在19名遺傳性視網膜母細胞瘤患者中發(fā)現了18種RB1基因突變，其中10個為國際首報。本研究發(fā)現的新突變包括6個移碼突變(p.Leu647HisfsX10，p.Asn598LysfsX13，p.Gly

17、310ValfsX6，p.Glu746GlyfsX3，p.Ser393LysfsX2，p.Va1314PhefsX2)，一個通過外顯子跳躍導致提前出現終止密碼(p.Thr841X)的剪接位點突變(c．2663+1G>A)，2個包含整個RB1基因的缺失突變，缺失范圍分別約為3Mb和10Mb；另外，在RNA水平上檢測到一個RB1基因15、16和17外顯子缺失突變(p.Glu464_Ser565del)，但造成這一剪接異常的DNA水平上的突變

18、仍未確定。通過RB1基因檢測，為31個家庭提供了遺傳咨詢：并通過檢測絨毛、羊水或臍血DNA中的RB1基因突變，為12名孕婦進行了產前基因檢測，檢出1例攜帶RB1基因突變的胎兒。 綜上，本研究豐富了中國人的RB1基因突變譜。經實踐證明，利用多種方法組合進行RB1基因突變篩查的策略靈敏有效，在19名遺傳性視網膜母細胞瘤患者中RB1基因突變檢出率達到100％，從而使RB1基因突變篩查有可能成為視網膜母細胞瘤患者的醫(yī)療方案的一個組成部分