豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制及豬源乙型腦炎病毒的分離鑒定.pdf

1、乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE，簡(jiǎn)稱(chēng)乙腦）是由日本乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)引起的急性自然疫源性蟲(chóng)媒傳播的人畜共患傳染病。JEV可引起成年母豬和公豬的繁殖障礙以及新生仔豬腦炎等，同時(shí)還能夠感染人群。JEV的感染呈豬-蚊-人鏈狀傳播，而豬是JEV最重要的宿主。監(jiān)測(cè)和預(yù)防豬乙腦的發(fā)生對(duì)于人乙腦的預(yù)防和控制具有重要意義。因此，建立快速準(zhǔn)確的診斷方法與安全有效的疫苗是

2、預(yù)防和控制該病的前提。本研究圍繞豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制和豬源乙型腦炎病毒的分離鑒定兩個(gè)方面展開(kāi)，具體內(nèi)容如下:
　　 1.豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制
　　 用滅活純化的JEV SA14-14-2株包被酶標(biāo)板，通過(guò)方陣滴定法確定抗原的最佳包被濃度為0.2μg/孔，被檢血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶40。試驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件為:包被液為pH值9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，封閉液為含0.

3、5％牛血清白蛋白、0.5％吐溫20的磷酸鹽緩沖液，抗原與血清結(jié)合的最佳反應(yīng)時(shí)間為30min，二抗的最佳稀釋倍數(shù)為1∶5000，羊抗豬酶標(biāo)二抗的最佳反應(yīng)時(shí)間為30min，底物的最佳反應(yīng)時(shí)間為10min。
　　 用該試劑盒檢測(cè)豬口蹄疫、豬瘟、豬2型圓環(huán)病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒病、豬偽狂犬病等陽(yáng)性血清，結(jié)果均為陰性，證明該試劑盒特異性良好，用質(zhì)控陽(yáng)性血清對(duì)本試劑盒進(jìn)行敏感性檢測(cè)，均能符合要求，批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)為0.78％

4、～6.54％，批間重復(fù)變異系數(shù)為1.29％～10.85％。保質(zhì)期試驗(yàn)結(jié)果表明，該試劑盒可在2～8℃保存10個(gè)月。與豬乙型腦炎病毒乳膠凝集試驗(yàn)抗體檢測(cè)試劑盒比較，其總符合率為87.9％。
　　 2.豬源乙型腦炎病毒的分離鑒定
　　 2012年9月從廣西南寧某豬場(chǎng)采集了疑似乙腦病毒感染的豬腦組織樣品，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)到1份乙腦陽(yáng)性病料。將該病料接種BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離，通過(guò)全基因組測(cè)序分析，結(jié)果分離到一株乙腦病

5、毒，命名為GX1209。該毒株的核苷酸長(zhǎng)度為10965bp，GC含量為53.5％。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析該毒株屬基因Ⅰ型，與XJ69株的核苷酸和氨基酸同源性最高都為99％。與SA14、SA14-14-2、P3的氨基酸同源性分別為98％、97％、98％。與廣西分離到的其他乙腦病毒毒株BL06-50、BL06-54、GX0523/44、GX0519，其氨基酸同源性都為99％。昆明乳鼠腦內(nèi)接種方法增殖該毒株，采用蝕斑形成單位(PFU)測(cè)定病毒滴度為1