大鼠馬尾神經(jīng)損傷模型的建立與OcT-6基因的修復(fù)作用研究.pdf

1、背景：
　　馬尾神經(jīng)的嚴(yán)重?fù)p傷導(dǎo)致的馬尾神經(jīng)綜合征在腰椎疾病患者中較常發(fā)生，其病程發(fā)病急，且致殘率高。及時(shí)的外科手術(shù)治療，并根除腰椎原發(fā)病后，患者預(yù)后往往不佳，多殘留有膀胱、肛門括約肌的功能障礙?？紤]到目前手術(shù)治療只能做到局部減壓，去除誘因，為馬尾神經(jīng)功能恢復(fù)創(chuàng)造可能條件，但始終無法直接修復(fù)馬尾神經(jīng)功能的損傷。因此尋找新的治療馬尾神經(jīng)損傷的方法就顯得尤為重要。
　　已有研究表明，馬尾神經(jīng)損傷多是由雪旺細(xì)胞的損傷即脫髓鞘的病理

2、改變開始，繼而出現(xiàn)軸突變性并導(dǎo)致相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元甚至相應(yīng)節(jié)段脊髓神經(jīng)元的凋亡，從而出現(xiàn)CES的各種神經(jīng)功能障礙。因此，探索一種能夠阻斷馬尾神經(jīng)組織神經(jīng)元細(xì)胞脫髓鞘改變和促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞再髓鞘化的方法成為馬尾神經(jīng)綜合征治療的重要研究方向。
　　OCT6是調(diào)控雪旺細(xì)胞(SC)的分化和髓鞘化的一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，可能在神經(jīng)組織早期發(fā)育中起到了重要的作用，并且有可能參與神經(jīng)組織修復(fù)。目前在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的研究中，關(guān)鍵基

3、因過表達(dá)技術(shù)已成為新發(fā)展起來的極有前景的治療策略?；谌祟惷庖呷毕莅Y病毒(HIV)制備的慢病毒，不易誘發(fā)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)，且毒性較低，可長(zhǎng)期穩(wěn)定的介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)，治療基因表達(dá)的時(shí)效可以長(zhǎng)達(dá)六個(gè)月，非常適用于修復(fù)神經(jīng)損傷。已有研究通過慢病毒局部注射的方法治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和脊髓損傷，但有關(guān)慢病毒治療馬尾神經(jīng)損傷的研究目前還未見報(bào)道。
　　本研究首先建立了新的大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型;其次構(gòu)建OCT6過表達(dá)慢病毒載體并包裝OC

4、T6過表達(dá)慢病毒;再次將OCT6過表達(dá)慢病毒注射到相應(yīng)受損馬尾神經(jīng)周圍腦脊液中，以期通過慢病毒感染細(xì)胞過表達(dá)OCT6，促進(jìn)髓鞘的再生和修復(fù)，從而達(dá)到修復(fù)馬尾神經(jīng)功能的目的;最后，利用RNA-seq手段檢測(cè)大鼠發(fā)生馬尾神經(jīng)損傷前后基因表達(dá)水平的改變，期望從中發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。
　　研究目的：
　　建立大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型;探索顯微注射（鞘內(nèi)移植）方法大鼠蛛網(wǎng)膜下腔植入OCT6過表達(dá)慢病毒的可行性;觀察OCT6過表達(dá)慢病毒在

5、大鼠體內(nèi)的感染情況和OCT6過表達(dá)后大鼠馬尾神經(jīng)功能修復(fù)的情況;利用RNA-seq手段檢測(cè)大鼠發(fā)生馬尾神經(jīng)損傷前后基因表達(dá)水平的改變，期望從中發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。
　　研究方法：
　　1、選取22只出生6周左右、體重約250克的實(shí)驗(yàn)SD大鼠，將大鼠隨機(jī)分為3組:手術(shù)組組，n=10;假手術(shù)組，n=6;對(duì)照組，n=6。每只大鼠在腰4處咬除椎骨背脊，用電鉆在咬除部位鉆一1.2mm小孔，鉆透椎板，將一枚平頭1.4mm不銹鋼平頭釘旋入小

6、孔后X光機(jī)輔助觀察下鉆入椎管腰4/5，建立大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型。模型建立3天后，運(yùn)用馬尾壓迫模型的BBB評(píng)分、馬尾壓迫模型的斜板實(shí)驗(yàn)、馬尾壓迫模型的壓痛測(cè)試等判定各實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)功能變化，確定模型建立成功。
　　2、獲得慢病毒過表達(dá)載體PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV;利用NCBI檢索大鼠OCT6 CDS全序列;通過PCR方法，從大鼠細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得CDNA，以CDNA為模版并設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出大鼠OCT

7、6 CDS全序列;將OCT6 CDS全序列構(gòu)建到慢病毒過表達(dá)載體PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV上，獲得PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6重組質(zhì)粒;最后進(jìn)行PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6慢病毒的包裝和滴度測(cè)定。
　　3、選取20只出生6周左右、體重約250克的實(shí)驗(yàn)SD大鼠，將大鼠隨機(jī)分為2組:PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6過表達(dá)慢病毒載

8、體鞘內(nèi)注射組，n=10;對(duì)照慢病毒組，n=10。建立大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型。模型建立7天后，取出螺釘，分別鞘內(nèi)注射PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6慢病毒（8μl/只）和注射等量的PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-Scramble慢病毒。術(shù)后在預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，取大鼠馬尾神經(jīng)組織進(jìn)行免疫組化熒光染色，觀察病毒在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染、分布情況。并定期運(yùn)用馬尾壓迫模型的BBB評(píng)分、馬尾壓迫模型的斜板實(shí)驗(yàn)、馬尾壓

9、迫模型的壓痛測(cè)試判定各實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)功能變化的恢復(fù)情況。
　　4、借助于最新的高通量測(cè)序技術(shù)，RNA-Seq來探究大鼠馬尾神經(jīng)在損傷前后的基因表達(dá)改變，分析數(shù)據(jù)，探究其中深層次的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立并改進(jìn)大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷模型。
　　2、PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6過表達(dá)慢病毒包裝成功，病毒滴度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。
　　3、PCDH-MCS-T2A-COPG

10、FP-MSCV-OCT6過表達(dá)慢病毒鞘內(nèi)注射后1周的時(shí)間中，可以在模型鼠體內(nèi)成功轉(zhuǎn)染。這表明宿主的腦脊液對(duì)于注射的PCDH-MCS-T2A-COPGFP-MSCV-OCT6過表達(dá)慢病毒來說是一個(gè)合適的微環(huán)境，并且通過行為學(xué)檢測(cè)模型大鼠的神經(jīng)功能得到明顯的改善。馬尾壓迫模型的BBB評(píng)分、馬尾壓迫模型的斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)病毒注射后，病毒注射組大鼠的神經(jīng)功能更加明顯的改善。
　　4、分析大鼠損傷馬尾神經(jīng)的差異基因表達(dá)，通過目前通用的KE

11、GG Pathway分析，發(fā)現(xiàn)了五項(xiàng)高度相關(guān)的信號(hào)通路。
　　結(jié)論：
　　改進(jìn)的馬尾神經(jīng)壓迫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮O(shè)計(jì)合理、穩(wěn)定性高、易于操作、復(fù)制性強(qiáng)。能真實(shí)有效的模擬腰椎管狹窄造成的馬尾神經(jīng)損傷的病理過程。通過慢病毒感染的方法，髓鞘內(nèi)注射OCT6過表達(dá)慢病毒可以有效的促進(jìn)大鼠馬尾神經(jīng)損傷的修復(fù)。OCT6過表達(dá)慢病毒在本實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)大鼠馬尾神經(jīng)損傷修復(fù)將通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。OCT6大鼠體內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)髓鞘再生、恢復(fù)神經(jīng)功能的機(jī)制尚待進(jìn)