GDNF基因轉(zhuǎn)染大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)脊髓神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討大鼠源性胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞(PMSCs)和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的培養(yǎng)方法并進(jìn)行鑒定，將膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)轉(zhuǎn)染PMSCs和BMSCs，并研究兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的生物學(xué)特性。比較轉(zhuǎn)染GDNF基因的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)脊髓神經(jīng)損傷的療效。為將PMSCs應(yīng)用于脊髓神經(jīng)損傷的修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:采用密度梯度離心的方法將PMSCs從SD大鼠的胎盤中分離出來，并在體外傳代、純

2、化、擴(kuò)增，BMSCs從SD大鼠的股骨骨髓中分離出來進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)比觀察兩種細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD34、CD45。以GDNF過表達(dá)慢病毒感染BMSCs和PMSCs，觀察觀察綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的表達(dá)情況。以MTT法檢測轉(zhuǎn)染GDNF基因的PMSCs與BMSCs的細(xì)胞活力，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后GDNF在PMSCs和BMSCs中的表達(dá)。將64只

3、SD大鼠制備脊髓打擊傷模型，造模成功后隨機(jī)分為四組:A組為單純PMSCs組，B組為單純BMSCs組，C組為PMSCs轉(zhuǎn)染組，D組為BMSCs轉(zhuǎn)染組，使用微量注射器依次注射單純細(xì)胞A-B組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞組C-D。于手術(shù)后7、14、28天對(duì)大鼠進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。于手術(shù)后7、14、28天行HE染色并鏡下觀察，采用免疫組織化學(xué)染色觀察NSE、GFAP、NF-200在脊髓內(nèi)的表達(dá)。
　　結(jié)果:大概30％的細(xì)胞在接種48-72小時(shí)后開始

4、貼壁。經(jīng)過4天的培養(yǎng)，PMSCs和BMSCs都呈長紡錘狀，隨后均以形態(tài)均勻的類似成纖維細(xì)胞樣集落生長。流式細(xì)胞術(shù)測定表明，PMSCs和BMSCs陽性高度表達(dá)CD29、CD90，不表達(dá)CD34、CD45，表明本研究分離培養(yǎng)所得PMSCs和BMSCs為間充質(zhì)干細(xì)胞。MOI=100時(shí)，轉(zhuǎn)染12小時(shí)后，PMSCs和BMSCs顯著表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)。細(xì)胞形態(tài)完整，沒有明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)。MTT法顯示轉(zhuǎn)染后PMSCs和BMSCs在3-5天時(shí)

5、呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長，6-7天生長速度減緩。轉(zhuǎn)染3天后，轉(zhuǎn)染后PMSCs和BMSCs組細(xì)胞活力明顯高于未轉(zhuǎn)染PMSCs和BMSCs組。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)術(shù)后1天，所有組實(shí)驗(yàn)大鼠下肢癱瘓。7d后，A、B、C、D組大鼠的運(yùn)動(dòng)機(jī)能略有改善，部分實(shí)驗(yàn)大鼠下肢有1-2個(gè)大關(guān)節(jié)能活動(dòng)。14天后，C、D組大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能改善，部分實(shí)驗(yàn)大鼠下肢大小關(guān)節(jié)活動(dòng)較好，A組、B組下肢功能恢復(fù)緩慢。28天后，C、D大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)明顯改善，部分實(shí)驗(yàn)大鼠能用雙下肢支撐身體重量，

6、A、B組大鼠下肢有所恢復(fù)。術(shù)后1、2、4周。C和D組的BBB評(píng)分沒有顯著差異(P＞0.05)。C和D組的評(píng)分，與A組、B組相比有顯著性差異(P＜0.05)。HE染色觀察，C組和D組問沒有顯著性差異，C組D組和A組，B組有顯著性差異，C，D組明顯優(yōu)于A，B組。GFAP和NSE免疫組化染色結(jié)果顯示脊髓損傷區(qū)C、D組GFAP大量表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度明顯比A、B組高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，C和D組間沒有顯著性差異(P＞0.05);NF-20

7、0免疫組化染色結(jié)果顯示脊髓損傷區(qū)C、D組NF-200陽性神經(jīng)纖維長度長于A、B組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。C和D組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:應(yīng)用密度梯度離心法能夠從大鼠胎盤組織中培養(yǎng)出大量增值能力較強(qiáng)的成纖維樣細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測顯示胎盤來源的間充質(zhì)細(xì)胞和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似的干細(xì)胞表面標(biāo)志。GDNF能夠成功轉(zhuǎn)染PMSCs和BMSCs，轉(zhuǎn)染后具有較高的細(xì)胞活性。PMSCs和BMSCs具有相似的