丙戊酸對大鼠脊髓損傷后神經修復作用及其機制的研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種給個人、家庭及社會帶來巨大醫(yī)療、心理和經濟負擔的突發(fā)性事件。大量的研究證明，成年哺乳動物只有外周神經可以再生，中樞神經系統(tǒng)(central nervous system，CNS)不能再生。與外周神經和胚胎CNS相比，損傷軸突不能再生的主要原因是：殘存成熟神經元內在的再生能力下降；CNS微環(huán)境中存在軸突生長抑制因子；膠質細胞增生形成的瘢痕阻礙軸突生長。近年來研究證明，當提供適當

2、的條件后CNS能夠再生，而且這些軸突的再生是由中樞神經元固有特性(intrinsic properties)和所處的環(huán)境決定的。然而許多措施雖然可以促進軸突出芽，但由于膠質細胞形成的膠質瘢痕和抑制因子阻礙了神經的生長，再生軸突中的大部分圍繞細胞或組織移植區(qū)生長，很少有神經纖維跨越損傷區(qū)而進入遠端，要建立功能性軸突聯系更加困難。如果能夠應用藥物進行干預，將是一種簡單易行的方法。目前臨床應用甲基強的松龍(mythylprednisolone

3、，MP)、治療性疫苗(therapeutic vaccination)等藥物來改變神經元內在的再生狀態(tài)，提高cAMP,失活Rho。有資料顯示，沒有足夠的證據表明MP對急性SCI有明顯的治療作用。在成年大鼠CNS的局部應用神經營養(yǎng)因子(NTF)能提高損傷神經元存活和損傷軸突的生長，但NTF家族其分子量大，很難透過血腦屏障，并且經過酶的降解作用使其對神經元保護作用和軸突的生長作用大大受限。因此尋求一種能夠通過血腦屏障且不易降解、無毒、具有類

4、似NTF作用的藥物是非常重要的。 丙戊酸(valproic acid，VPA)是一種分子量很小的短鏈脂肪酸，具有迅速穿過BBB的特性。它作為抗癲癇和抗驚厥的一線藥物，已在臨床應用近40年。最近的研究發(fā)現，VPA在大腦和體外細胞培養(yǎng)中具有保護、營養(yǎng)和抑制神經元凋亡的作用；能夠對抗脂多糖產生的神經毒作用；使培養(yǎng)中的細胞內氧化作用降低；降低炎癥因子的水平，保護多巴胺神經元，減少星形膠質細胞和小膠質細胞的增生；能夠使哺乳動物神經元生長錐

5、膨大，防止塌陷，從而促進神經生長；對損傷后的外周神經有明顯促進生長的作用，并加速其髓鞘化。促進培養(yǎng)中的腦源性神經干細胞(neural stem cells,NSCs)向神經元分化，對于大鼠NSCs培養(yǎng)分化后，其促進神經生長的效果優(yōu)于BDNF和NT3。 關于VPA對SCI的研究很少，它能否保護脊髓神經元；促進殘存神經元軸突生長；抑制神經膠質細胞增生?本研究的目的是觀察VPA對大鼠SCI后的修復作用，并對其機制進行研究，為臨床SCI

6、提供治療策略，同時對SCI后呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥的原因進行初步的探索。 主要方法及技術路線 實驗分為四個部分 1．采用孕13-16天的Wistar胎鼠脊髓組織，在體外用NB(Neural basal medium，NB)培養(yǎng)液進行NSCs培養(yǎng)，采用Nestin進行免疫熒光鑒定NSCs。在分化時加入含有濃度為1.0mM VPA的培養(yǎng)基，分化后用GFAP和NF-200進行免疫熒光雙標，觀察VPA對NSCs分化的影響。

7、 2．制備Wistar大鼠T10脊髓平面的Allen's打擊損傷模型，打擊力度為25 g·cm。實驗動物分為對照組(A組)；單純損傷組(B組)；損傷后MP治療組(C組)和損傷后VPA治療組(D組)；C組于損傷后半小時內首次按30mg/kg，隨后按5.4mg/kg/h給予MP，每1小時給藥一次，連續(xù)給23次；D組于損傷后半小時經腹腔按300mg/kg/d，分兩次給藥；B組同D組一樣每日給予等量的生理鹽水，觀察8w。采用BBB評分、神經電

8、生理和BDA神經順行示蹤技術，評價VPA對SCI后的神經修復作用。 3．建立大鼠Allen's打擊損傷模型，將動物分為對照組(A組)、單純損傷組(B組)和VPA治療組(C組)。每個組又按不同時相點分為1d,3d,1w,2w,4w，通過病理學、TUNEL技術和電子顯微鏡觀察VPA對SCI后神經細胞的保護作用；應用Nestin免疫組化染色，Brdu與NF-200免疫熒光雙標，觀察VPA對內源性NSCs的作用；采用Brdu免疫組化和G

9、FAP與NF-200免疫熒光雙標，觀察VPA對神經元的保護作用和對星形膠質細胞增殖的影響； 4．制備Wistar大鼠T10脊髓平面的Allen's打擊損傷模型，打擊力度為25 g·cm。將動物分為對照組(A組)和實驗組(B組)。A組只切除椎板組，B組為SCI。每個組又按照不同時相點分為1d,3d,1w,2w,4w。取肺組織，通過大體標本和病理學觀察SCI后肺組織形態(tài)學變化；并通過濕干重之比(W/D)測定肺組織水腫程度。

10、主要結果及結論： 1．在脊髓源性NSCs的培養(yǎng)中，加入含有濃度為1.0mM VPA的血清培養(yǎng)基2w，與對照組比較，分化成神經元的數目明顯比對照組多(p<0.01)，而星形膠質細胞的比例比對照組少(p<0.01)。表明VPA能夠促進脊髓源性NSCs向神經元分化，抑制NSCs向星形膠質細胞分化。 2．大鼠SCI后，A組8w時BBB評分為21分；而B組8w時為17.46±1.98：C組為17.53±1.76；D組為19.87±

11、1.89(p<0.05)。8w時，B組MEP潛伏時為11.06±1.18；C組為10.88±1.42；而D組為8.90±0.80(p<0.05)。B組SEP潛伏時為15.75±1.04；C組為15.09±1.32；而D組為13.25±0.89(p<0.05)。BDA神經示蹤顯示：8w時DBA標記到的皮質脊髓束A組為32.23±3.21；B組為17.52±3.98：C組為18.09±4.21；D組為25.26±4.84(p<0.05)。上

12、述結果表明VPA對大鼠SCI后的神經修復有一定的促進作用。而MP對大鼠SCI后的功能恢復沒有明顯作用(p>0.05)。 3．大鼠SCI后3d，TUNEL陽性細胞數目達到高峰，C組凋亡指數為25.24±4.05；B組凋亡指數38.21±4.55；明顯高于C組(p<0.05)，隨后開始下降。電子顯微鏡掃描結果顯示：神經元胞核染色質邊集，胞核增大，出現凋亡小體的細胞在B組較C組多。結果表明：VPA能夠抑制神經元凋亡，這可能是SCI后V

13、PA促進神經功能恢復的主要原因之一。 4．大鼠SCI后24h，B組Nestin表達與C組無顯著差異；1w時C組在中央管周圍Nestin陽性細胞明顯較B組多(p<0.05)，持續(xù)至4w時仍高表達。B組4w時Nestin表達明顯下降，8w時很少或幾乎無表達(p<0.05)。中央管周圍許多Nestin陽性表達的細胞證明：大鼠SCI后，損傷啟動某些細胞表達Nestin。Brdu與NF-200免疫熒光雙標顯示：中央管周圍發(fā)現Brdu與NF

14、-200共表達的陽性細胞證明，SCI能夠誘導脊髓發(fā)育和再生。結果表明：SCI能夠激活內源性NSCs，而VPA能夠進一步促進NSCs的增殖，并可能促進其向神經元分化。這可能是VPA促進神經功能恢復的另一個原因。 5．大鼠SCI后3d，C組和B組灰質中Brdu陽性細胞都增多，但B組較C組明顯多。1w時陽性細胞數量達到高峰，B組多于c組(p<0.05)。4w時兩組陽性數目都很少，在統(tǒng)計學上無顯著差異(p>0.05)。4w時GFAP與N

15、F-200免疫熒光雙標顯示，B組神經元數目明顯減少，后角幾乎沒有。星形膠質細胞很多，且雜亂排列。C組神經神經元數目較B組多(p<0.05)，而星形膠質細胞數目相對較少(p<0.05)。結果表明：大鼠SCI后，VPA能夠抑制損傷脊髓星形膠質細胞增殖，減輕膠質瘢痕的增生。為再生軸突的穿越奠定了基礎。 6．大鼠SCI后，大體標本觀察到，12h肺部出現出血和水腫，3d最為嚴重，1w開始緩解，4w基本恢復正常。鏡下：實驗組于6h出現散在肺