大鼠視神經(jīng)電刺激損傷定量模型的建立和評價.pdf

1、目的： 隨著神經(jīng)生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，視神經(jīng)損傷和再生的研究成為眼科學(xué)和神經(jīng)科學(xué)共同關(guān)注的課題。 為了從不同的角度對視神經(jīng)損傷進(jìn)行研究，學(xué)者們建立了多種視神經(jīng)損傷模型。間接性損傷模擬臨床上閉合性顱腦損傷，由于人和動物解剖結(jié)構(gòu)的差異，并且間接性視神經(jīng)損傷機(jī)制復(fù)雜，不能完全代替臨床間接性視神經(jīng)損傷。直接損傷可控性強(qiáng)，損傷可以具體化，易于統(tǒng)一損傷標(biāo)準(zhǔn)。目前直接視神經(jīng)損傷模型多為完全損傷，視神經(jīng)橫斷傷是視神經(jīng)損傷動物模型

2、中最易建立、最易于統(tǒng)一損傷標(biāo)準(zhǔn)的動物模型，致傷量一致，便于對照研究。國外對視神經(jīng)部分損傷定量分析主要有兩種模型方法：牛頓測力計模型和螺旋測微計標(biāo)定反向鑷損傷模型，但兩者也只是一種半定量損傷，雖然這兩種模型均可造成不同程度的視神經(jīng)損傷，但不夠簡便，而且對致傷強(qiáng)度和損傷程度的量化探討不夠深入。 為了深入研究視神經(jīng)損傷，要建立一種易于量化、標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)的不同程度視神經(jīng)損傷的動物模型，對致傷強(qiáng)度、損傷程度進(jìn)行量化，對視神經(jīng)損傷程度在結(jié)

3、構(gòu)上和功能上進(jìn)行定量分析；明確致傷強(qiáng)度和損傷程度之間的聯(lián)系，即多大的致傷強(qiáng)度能造成多大程度的損傷以及損傷后結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，同時要使這種模型影響因素單一。這對視神經(jīng)損傷后再生研究有重要價值。 對顱內(nèi)段視神經(jīng)給予不同強(qiáng)度的電刺激，用電刺激視神經(jīng)所用電功量化損傷強(qiáng)度，用視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞計數(shù)量化損傷程度，以此來標(biāo)準(zhǔn)化、量化視神經(jīng)損傷，探討致傷強(qiáng)度和視神經(jīng)損傷程度之間的關(guān)系。 材料和方法： 選用健康成年雄性wister大鼠1

4、80只，體重260-300g，雙眼屈光間質(zhì)清澈及眼底檢查正常。 160只動物分成5個刺激電流強(qiáng)度組，0.1mA，0.25mA，0.5 mA，0.75 mA，1.0 mA；每組根據(jù)刺激時間再次分為8個亞組(每個亞組4只)，5secs，10 sees，20 secs，30 sees，45 secs，60 sees，75 secs，90 secs，動物隨機(jī)分配到各組中。對照組：20只未處理的大鼠作為對照，隨機(jī)分配到5個不同刺激強(qiáng)度組。

5、 統(tǒng)一選取右眼作為試驗(yàn)對象。在腦立體定位儀下，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)視神經(jīng)電損傷鉆顱位置(Bregina．點(diǎn)前移0.2mm，中線旁開3mm)，微電極毀損顱內(nèi)段視神經(jīng)，毀損電壓為5 V，頻率為60 KHz，通過改變電流強(qiáng)度和刺激時間，造成不同程度視神經(jīng)損傷。2周后再次麻醉大鼠，4％多聚甲醛磷酸緩沖液心臟灌注后取標(biāo)本，去除中央?yún)^(qū)角膜和晶狀體，盡可能完全去除玻璃體，沿矢狀位方向行視網(wǎng)膜全層切片，片厚4μm，HE染色后計數(shù)視神經(jīng)

6、節(jié)細(xì)胞層的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。 刺激電流強(qiáng)度及刺激時間對視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響采用析因設(shè)計的方差分析；視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)的均數(shù)在刺激電流及刺激時間間差異采用LSD法做多重比較，P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)；刺激強(qiáng)度和刺激時間單獨(dú)效應(yīng)采用one-wayANOVA分析。電功(電功=電壓×電流×?xí)r間)和視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)之間的關(guān)系采用多個獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis Test；檢驗(yàn)電功和視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)是否為正態(tài)分布采用One-Sam

7、ple Kolmogorov-Smirnov Test,雙變量相關(guān)分析采用等級相關(guān)系數(shù)(Spearman相關(guān)系數(shù))非參數(shù)檢驗(yàn)；畫出散點(diǎn)圖，電功(致傷量)進(jìn)行變換后進(jìn)行曲線擬合。 結(jié)果： 正常對照組視網(wǎng)膜層次清晰，各層排列整齊而致密，視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的細(xì)胞單層排列，大小不一，輪廓不規(guī)則，胞核大小不一，染色質(zhì)分布均勻。從核形態(tài)學(xué)上可明確分為兩類：一類為大而淺染的細(xì)胞核，胞核有時可見核仁； 另一類為小而深染的細(xì)胞核

8、。另外可見少量的呈新月形的血管內(nèi)皮細(xì)胞分布于毛細(xì)血管內(nèi)表面。不同強(qiáng)度視神經(jīng)損傷后同側(cè)視網(wǎng)膜出現(xiàn)不同程度的以下改變：散在空泡化視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、節(jié)細(xì)胞排列紊亂、節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少。刺激電流和刺激時間對大鼠視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響：析因方差分析結(jié)果提示，不同刺激時間之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3472.142，P<0.001)，視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)由高到低依次為對照組(45.55±1.19)，5sec(36.65±2.92)，10sec(32.25±4.58)

9、，20sec(25.40±7.07)，30sec(19.35±5.78)，45sec(13.75±3.80)，60sec(10.35±1.87)，75sec(8.20±1.11)，90sec(7.25±0.85)：電流強(qiáng)度組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(F=335.83，P=0.000)，以0.1mA水平測得的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)最多(26.67±13.99)，其余各組依次為23.64±13.34，21.64±13.26，19.98±12.96，1

10、8.69±13.17；選LSD法做多重比較，視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)均數(shù)在刺激電流之間及刺激時間之間差異在α=0.05水平均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；刺激強(qiáng)度和刺激時間的單獨(dú)效應(yīng)，除對照組和刺激時間點(diǎn)為90sec外(F=0.792，P=0.548；F=1.538，P=0.242)，同一刺激時間隨著電流強(qiáng)度增加，細(xì)胞計數(shù)呈下降趨勢；同一電流組隨著刺激時間的增加，細(xì)胞計數(shù)也呈下降趨勢，刺激電流強(qiáng)度和刺激時間之間交互效應(yīng)顯著(F=27.298，

11、P<0.001)。 致傷強(qiáng)度(電功)對視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)的影響行多個獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis Test。不同電功組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X<'2>=168.083，P=0.000)，不同電刺激強(qiáng)度對視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)的影響不同。經(jīng)One-Sarnple Kolmo-gorov-Smirnov Test，視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)為非正態(tài)分布，因此選擇等級相關(guān)系數(shù)(Spearman相關(guān)系數(shù))非參數(shù)檢驗(yàn)，經(jīng)相關(guān)分析，Spear

12、man相關(guān)系數(shù)r<,s>=-0.953，P=0.000(雙側(cè))，故認(rèn)為致傷量和視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。將致傷量(電功)做變量變換后進(jìn)行曲線擬合，致傷量和視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)之間有冪函數(shù)關(guān)系。 結(jié)論： 1．電毀損顱內(nèi)段視神經(jīng)大鼠動物模型致傷因素單一，對致傷強(qiáng)度、損傷程度易于控制和量化。 2．該模型在致傷強(qiáng)度和損傷程度間建立了對應(yīng)關(guān)系：致傷強(qiáng)度和損傷程度間成冪函數(shù)曲線關(guān)系。 因此，電毀損大鼠顱內(nèi)段視神