周期性動態(tài)壓力對成骨細(xì)胞CLC-3離子通道影響的機(jī)制研究.pdf

1、骨組織對外界刺激特別敏感，能夠感受到各種化學(xué)和力學(xué)信號的刺激。成骨細(xì)胞的形態(tài)、分化和增殖均與力學(xué)刺激有關(guān)。當(dāng)機(jī)械外力作用于骨組織時，成骨細(xì)胞處于組織的應(yīng)力環(huán)境中，應(yīng)力刺激細(xì)胞膜并通過微絲和微管傳遞到細(xì)胞核，應(yīng)力信號在傳遞過程中引起一系列生化反應(yīng)，從而刺激成骨細(xì)胞內(nèi)各種成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)，影響骨的形成及改建。目前有關(guān)各種應(yīng)力環(huán)境下成骨效應(yīng)的研究雖然較多，但大部分為牽張力及流體剪切力對骨組織或成骨細(xì)胞的影響，而壓力對成骨細(xì)胞刺激的研究多

2、采用靜態(tài)壓力模式，且為持續(xù)靜態(tài)壓力，關(guān)于動態(tài)壓力刺激對骨組織的作用效應(yīng)較少報(bào)導(dǎo)。近年來研究發(fā)現(xiàn)Ca2+、K+、Cl–等離子通道均與成骨細(xì)胞的分化有關(guān)，其中CLC型氯通道是最重要的一種陰離子通道，它的突變和功能異?？梢鸲喾N疾病。CLC-3型氯通道是電壓門控型氯通道之一，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞容積、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及凋亡等。研究表明CLC-3基因促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription fa

3、ctor2, Runx2)有關(guān)。轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子Runx2是成骨細(xì)胞分化的重要因子，它參與多種細(xì)胞內(nèi)外信號的傳遞，其中BMP-2-Smads-Runx2信號通路在外界刺激成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。在成骨細(xì)胞分化過程中，多種成骨細(xì)胞特異性基因如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2, BMP-2)、Runx2、骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)等成骨分化相關(guān)基因陸續(xù)表達(dá)，分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，調(diào)控

4、細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，逐步完成機(jī)體內(nèi)骨組織的形成。最近研究發(fā)現(xiàn)一定時間和大小的靜態(tài)壓力刺激能引起成骨細(xì)胞內(nèi)CLC-3表達(dá)的增加，并促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，但應(yīng)用Flexcell細(xì)胞加壓系統(tǒng)研究周期性動態(tài)壓力對成骨細(xì)胞CLC-3離子通道的影響及其機(jī)制尚未見報(bào)導(dǎo)。本課題應(yīng)用Real-time PCR及Western blot等方法分三部分研究周期性動態(tài)壓力對成骨細(xì)胞CLC-3的影響及其機(jī)制。第一部分：周期性動態(tài)壓力對成骨細(xì)胞CLC-3離子通道及成骨

5、分化相關(guān)基因表達(dá)的影響；第二部分：Chlorotoxin對成骨細(xì)胞CLC-3離子通道及成骨分化相關(guān)基因加壓后表達(dá)的影響；第三部分：周期性動態(tài)壓力對CLC-3離子通道及成骨細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　第一部分：周期性動態(tài)壓力對成骨細(xì)胞CLC-3離子通道及成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　目的：觀察周期性動態(tài)壓力對成骨細(xì)胞MC3T3-E1超微結(jié)構(gòu)的影響；探討周期性動態(tài)壓力對成骨細(xì)胞CLC-3離子通道及成骨分化相關(guān)基因BMP-

6、2、Runx2及OPN表達(dá)的影響。
　　方法：自中科院上海細(xì)胞庫購置小鼠顱頂成骨細(xì)胞MC3T3-E1，于12孔板(含有10％FBS及50μg/ml抗壞血酸的培養(yǎng)基)內(nèi)培養(yǎng)，在第14天時加入2mM的β-甘油磷酸鈉，連續(xù)培養(yǎng)至28天，形成約1-2mm厚的3D細(xì)胞膜。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組及對照組，實(shí)驗(yàn)組：收集3D細(xì)胞膜，并用吸管放入到Biopress培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，每個培養(yǎng)孔加入1.5ml含5％FBS，100U/ml青霉素，100μg/m

7、l鏈霉素和4mM谷氨酰胺的CO2敏感性培養(yǎng)基(Invitrogen公司，法國)。利用生物力學(xué)加載系統(tǒng)(Flexcell公司,美國)分別對各培養(yǎng)孔中的細(xì)胞膜加載壓力，加力等級為30Kpa，頻率為1Hz，1/2的正弦波形壓力下加載2、4、8h。壓力加載后，取出該3D細(xì)胞膜，IV型骨膠原酶消化并分離3D膜中的成骨細(xì)胞備用(3mg/ml，37℃條件下攪拌30min)。應(yīng)用透射電鏡觀察周期性動態(tài)壓力條件下MC3T3-E1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；采用R

8、eal-time PCR法檢測CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN mRNA的表達(dá)；Western blot方法檢測CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN蛋白的表達(dá)。對照組：細(xì)胞不加壓，余處理同實(shí)驗(yàn)組。
　　結(jié)果：經(jīng)透射電鏡觀察MC3T3-E1細(xì)胞，可見加壓前細(xì)胞表面少量突起，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見少量線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體等細(xì)胞器。加壓2h后，細(xì)胞表面突起輕度增加，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體等細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器輕度增加。加

9、壓4h后，細(xì)胞表面突起明顯增多，核仁變明顯，胞核位于細(xì)胞的一側(cè)，胞漿中可見散在豐富的溶酶體及糖元，胞核周圍可見較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體及散在的橢圓形線粒體。加壓8h后，細(xì)胞較加載4h細(xì)胞表面突起略有增多，高爾基復(fù)合體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體也進(jìn)一步增多。
　　對照組2、4、8h后CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN mRNA及蛋白均無明顯變化(P>0.05)。與對照組比較，動態(tài)壓力加載MC3T3-E1細(xì)胞2、4、8h后，細(xì)

10、胞內(nèi)CLC-3及成骨分化相關(guān)基因BMP-2、Runx2及OPN在mRNA及蛋白水平均明顯上調(diào)(P<0.05)。
　　第二部分：Chlorotoxin對成骨細(xì)胞CLC-3離子通道及成骨分化相關(guān)基因加壓后表達(dá)的影響
　　目的：觀察Chlorotoxin(Cltx，CLC-3特異性阻滯劑)阻斷CLC-3離子通道后周期性動態(tài)壓力對MC3T3-E1細(xì)胞中CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN基因表達(dá)的影響。
　　方法:

11、>　　3D細(xì)胞膜的制備及細(xì)胞提取同第一部分。
　　為研究加入Chlorotoxin后，細(xì)胞加壓后CLC-3及成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因BMP-2、Runx2及OPN的表達(dá)變化，我們將實(shí)驗(yàn)分為兩組。
　　1、實(shí)驗(yàn)組一：細(xì)胞加壓且不加Cltx組。
　　MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)過30Kpa，頻率為1Hz，1/2正弦波形的動態(tài)壓力8h后，取出3D細(xì)胞膜，IV型骨膠原酶消化并分離3D細(xì)胞膜中的細(xì)胞，應(yīng)用Real-time PCR及Wes

12、tern blot方法檢測CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN基因mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　2、實(shí)驗(yàn)組二：細(xì)胞加壓且加入Cltx組。
　　細(xì)胞加壓前30分鐘應(yīng)用Cltx阻斷CLC-3離子通道，然后給予加力等級為30Kpa，頻率為1Hz，1/2的正弦波形動態(tài)壓力培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞8h后， Real-time PCR及Western blot方法檢測CLC-3、BMP-2、Runx2及OPN基因mRNA及蛋白的表達(dá)

13、。
　　結(jié)果：與加壓不加Cltx組比較，應(yīng)用Cltx阻斷CLC-3離子通道周期性動態(tài)壓力條件下培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞8h后，CLC-3 mRNA和蛋白的表達(dá)無明顯降低(P>0.05)，而BMP-2、Runx2及OPN基因mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯下降，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　第三部分：周期性動態(tài)壓力對CLC-3離子通道及成骨細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　目的：檢測成骨細(xì)胞MC3T3-E1經(jīng)過不同時間

14、周期性動態(tài)壓力作用后細(xì)胞內(nèi)CLC-3離子通道及增殖相關(guān)基因PCNA及Ki67 mRNA及蛋白的表達(dá)，并探討其相關(guān)性。
　　方法：3D細(xì)胞膜的制備及細(xì)胞提取同第一、二部分。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組及對照組，實(shí)驗(yàn)組：收集3D細(xì)胞膜，并用吸管放入到Biopress培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，每個培養(yǎng)孔加入1.5ml含5％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素和4mM谷氨酰胺的CO2敏感性培養(yǎng)基(Invitrogen公司，法國)。利用生物力學(xué)

15、加載系統(tǒng)(Flexcell公司,美國)分別對各培養(yǎng)孔中的細(xì)胞膜加載壓力，加力等級為30Kpa，頻率為1Hz，1/2的正弦波形壓力下加載2、4、8h。壓力加載后，取出3D細(xì)胞膜，IV型骨膠原酶消化并分離3D膜中的成骨細(xì)胞(3mg/ml，37℃條件下攪拌30min)。Real-time PCR檢測CLC-3及增殖相關(guān)基因PCNA及Ki67 mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測CLC-3、PCNA及Ki67蛋白的表達(dá)。對照組：細(xì)胞不

16、加壓，余處理同實(shí)驗(yàn)組。
　　結(jié)果：對照組2、4、8h后CLC-3、Ki67及PCNA mRNA及蛋白均無明顯變化(P>0.05)。與對照組比較，動態(tài)壓力作用于成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞2、4、8h后CLC-3基因在mRNA及蛋白水平表達(dá)均明顯增加(P<0.05)，成骨細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA及Ki67在mRNA及蛋白水平上無明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、周期性動態(tài)壓力可促進(jìn)CLC-3表達(dá)，增加細(xì)胞膜

17、表面CLC-3離子通道的數(shù)量。
　　2、伴隨CLC-3表達(dá)的增加，BMP-2，Runx2及OPN的表達(dá)也相應(yīng)增加，成骨細(xì)胞分化可能與CLC-3型氯通道有關(guān)。
　　3、周期性動態(tài)壓力可上調(diào)成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因BMP-2、Runx2及OPN的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。
　　4、 CLC-3離子通道特異性阻滯劑Cltx不影響成骨細(xì)胞CLC-3基因的表達(dá)，但可減少有功能的CLC-3離子通道的數(shù)量。
　　5、 CLC-3基

18、因促進(jìn)成骨細(xì)胞分化是通過有功能的CLC-3離子通道實(shí)現(xiàn)的。
　　6、成骨分化相關(guān)基因BMP-2、Runx2及OPN的表達(dá)與有功能的CLC-3離子通道數(shù)量有關(guān)。
　　7、在30Kpa，頻率為1Hz，1/2的正弦波形動態(tài)壓力下加壓2、4、8h后對成骨細(xì)胞的增殖活性無明顯影響。
　　8、在30Kpa，頻率為1Hz，1/2的正弦波形動態(tài)壓力下加壓2、4、8h后，CLC-3基因的表達(dá)與成骨細(xì)胞增殖相關(guān)基因Ki67及PCNA無明顯