共培養(yǎng)條件下脂肪細胞脂毒性對成骨細胞影響的機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
  隨著人民生活水平的提高,飲食結構及生活作息不良所導致的肥胖、骨質疏松等亞健康狀態(tài)日趨嚴重,II型糖尿病、胰島素抵抗等疾病的發(fā)病率亦呈逐年升高的趨勢,且患者一旦患病往往需要終生服藥,影響生活質量。研究發(fā)現在這些病理條件下,人體內會產生大量脂肪組織,在骨髓腔中也可觀察到大量脂肪細胞蓄積,使髓腔呈現黃色。脂肪細胞在髓腔中的蓄積會抑制成骨細胞增殖、分化和功能,對骨組織的代謝產生非常嚴重的影響。雖然成骨細胞增殖分化相關的重要

2、分子序貫發(fā)生的框架已經建立完成,但是脂肪細胞對成骨細胞產生脂毒性的具體分子生物學機制卻仍未明確。
  游離脂肪酸(Free fatty acids,FFAs)可以對多種細胞的活性起到抑制作用。脂肪細胞通過脂解作用,將胞內的脂滴分解成游離脂肪酸,在大部分情況下,游離脂肪酸含量的異常升高會通過線粒體脂肪酸β氧化作用產生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),而活性氧的產生又可以進一步激活下游信號通路級聯

3、反應,從而對細胞凋亡、增殖、分化產生影響。因此游離脂肪酸的含量將直接影響細胞的生物學活性。
  地塞米松是一個廣泛應用于臨床的糖皮質激素類藥物,長期大劑量使用會導致嚴重的骨質疏松甚至骨壞死,文獻報道地塞米松可以促進脂肪細胞脂解作用從而增加游離脂肪酸的含量。二甲雙胍可以延緩胃腸道對葡萄糖的吸收速率,提高胰島素的敏感性,抑制肝的糖異生。對于非胰島素依賴性糖尿病有非常好的治療效果,同時可以降低體脂含量。研究發(fā)現二甲雙胍可以抑制脂肪細胞脂

4、解從而減少游離脂肪酸的含量。
  MAPKs信號轉導通路(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是存在于細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在大多數細胞內均檢測到MAPKs信號轉導通路,該信號通路在將細胞外刺激級聯傳遞至細胞及核內,并引起細胞生物學反應如增殖、分化、凋亡等的過程中具有至關重要的作用。MAPKs信號通路在骨形成過程中起到關鍵的作用,但由于所處上游可以干擾幾乎與骨形成所有相關的

5、分子通路(如Ihh-PTHrP、BMP、Wnt-β-catenin、EGF、FGF),因此在不同外界因素的刺激下可導致促進或抑制骨形成兩種截然不同的結果出現。ROS可以激活細胞內 MAPKs信號通路。
  研究目的:
  ①探討脂肪細胞對成骨細胞增殖、分化的影響,建立脂肪細胞/成骨細胞共培養(yǎng)體系;探索不同濃度地塞米松、二甲雙胍對成骨細胞增殖、分化,脂肪細胞成脂、分化的影響,為后期實驗選擇合適劑量濃度;
 ?、诜治龉才囵B(yǎng)

6、體系中氧化應激水平的變化,探討氧化應激水平與游離脂肪酸兩者間的關系;游離脂肪酸含量測定以及地塞米松、二甲雙胍對游離脂肪酸含量的影響;
 ?、厶接懝才囵B(yǎng)體系下對成骨細胞生物學活性影響的主要分子機制。
  方法與結果:
 ?、偈紫冉⒊芍毎?、成骨細胞共培養(yǎng)體系,為后期實驗建立合適的實驗模型。選用3T3-L1小鼠前成脂細胞系和MC3T3-E1小鼠前成骨細胞系,兩細胞系分別進行成脂誘導和成骨誘導12天后,通過 qRT-PCR

7、分別對成脂相關基因 PPAR-γ、Adiponectin、FABP以及成骨相關基因RunX2、Col A1、osteocalcin進行測定,并行染色學鑒定確定兩細胞系均已分化為成熟的脂肪細胞和成骨細胞,用于共培養(yǎng)及后續(xù)實驗。
 ?、谠诠才囵B(yǎng)體系下測定成骨細胞增殖及分化能力的改變。發(fā)現Adipocyte/Osteoblast(AD/OB)共培養(yǎng)組,成骨細胞凋亡較對照組明顯增加,且在早期AD/OB組較OB/OB組細胞增殖能力受到抑制,

8、后期AD/OB組成骨能力也明顯減弱。提示脂肪細胞可以抑制成骨細胞的生物學活性。
 ?、圻M一步研究發(fā)現,共培養(yǎng)體系 AD/OB組 FFAs較 OB/OB組有明顯增加,PAI-1、MCP-1、leptin、adiponectin、IL-6含量較OB/OB組變化不明顯,無統(tǒng)計學差異。
  ④地塞米松、二甲雙胍可以分別作用于脂肪細胞和成骨細胞,對兩細胞的增殖及分化產生影響,且存在劑量依賴關系。共培養(yǎng)體系下發(fā)現FFAs含量可以受到地塞

9、米松和二甲雙胍的影響,地塞米松可以促進 FFAs含量的升高,二甲雙胍可以抑制FFAs生成,且均存在劑量依賴關系。同時兩藥物還對 PAI-1、MCP-1、leptin、adiponectin、IL-6含量起到一定影響,但無統(tǒng)計學意義。
 ?、菰诠才囵B(yǎng)體系中分別加入FFAs、地塞米松、二甲雙胍,通過改變FFAs含量發(fā)現對MC3T3-E1凋亡、增殖及成骨分化能力有明顯影響。提示FFAs在脂肪細胞對成骨細胞的影響中扮演重要角色。
 

10、?、逓榱朔治龉才囵B(yǎng)體系下氧化應激水平的變化,檢測MDA、SOD活性、GSH-Px活性、ROS含量,發(fā)現AD/OB組抗氧化水平明顯降低,而ROS含量明顯增高。單純添加FFAs、地塞米松后可以提高ROS含量,而二甲雙胍可以降低ROS的含量。添加ROS抑制劑NAC后,可以改善AD/OB組成骨細胞增殖及成骨分化能力??紤]是由于FFAs提高成骨細胞氧化應激水平,從而進一步影響其細胞活性。
 ?、?Wester blot檢測發(fā)現,AD/OB組

11、Akt、Erk、P38磷酸化水平明顯升高,在分別添加FFAs和地塞米松后將進一步提高Akt、Erk、P38磷酸化水平,而加入二甲雙胍后可以抑制三者磷酸化水平的升高,并可以抑制地塞米松的作用。這一結果表明FFAs可以通過Akt、Erk、P38信號通路的改變來影響成骨細胞活性。
 ?、嗤ㄟ^應用LY294002(Akt信號通路抑制劑)、SB203580(P38信號通路抑制劑)、PD98059(Erk信號通路抑制劑)發(fā)現,抑制Erk和P3

12、8信號通路可以明顯降低共培養(yǎng)體系下脂肪細胞抑制成骨細胞增殖、分化的毒性作用。共培養(yǎng)體系中加入NAC后,觀察到Akt、Erk、P38磷酸化水平發(fā)生明顯的抑制。提示脂肪細胞在AD/OB共培養(yǎng)體系下是通過FFAs-ROS-P38/Erk通路對成骨細胞增殖、分化起到抑制作用。
  研究結論:
  通過本課題的研究,我們發(fā)現共培養(yǎng)體系下脂肪細胞對成骨細胞凋亡、增殖、分化起抑制作用,闡明了該過程的分子機制,明確了FFAs-ROS-Erk

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