大鼠彌漫性腦損傷腦干Aβ及NGB早期變化的研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）指機(jī)械性外力作用于頭部發(fā)生的損傷，存在一個或者多個繼發(fā)性病變，如顱骨骨折、創(chuàng)傷性顱內(nèi)損傷、神經(jīng)病學(xué)或者神經(jīng)心理學(xué)改變、意識障礙或者死亡。當(dāng)今社會，每年有超過1000多萬人因TBI而入院或者死亡，其死亡率高達(dá)30％~50%，它是威脅人類生命的重要疾患之一。腦部結(jié)構(gòu)復(fù)雜主要表現(xiàn)在各個部位的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能差異較大這兩個方面，造成TBI的種類多種多樣。彌漫性腦損傷（diff

2、use brain injury，DBI）是指機(jī)械性外力作用于頭部引起顱腔內(nèi)腦組織發(fā)生位移造成的損傷，是TBI的重要組成部分。近年交通事故傷和墜落傷的發(fā)生率明顯提高，DBI已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的重要損傷。法醫(yī)學(xué)中與DBI相關(guān)的案件數(shù)量逐年增加，但因DBI及其并發(fā)癥的復(fù)雜性，容易導(dǎo)致法醫(yī)學(xué)鑒定錯誤地發(fā)生和案件的真相被掩蓋。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和對DBI的深入性研究，相關(guān)的診斷設(shè)備及方法逐漸增多。目前法醫(yī)學(xué)上多依據(jù)臨床資料、解剖檢

3、驗、普通組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測技術(shù)對DBI進(jìn)行診斷、病情評估及損傷時間的推斷。但是，大多數(shù)情況下DBI后顱腦神經(jīng)影像學(xué)并沒有特異性的表現(xiàn)；另一方面，實(shí)踐中處理與DBI相關(guān)死亡的醫(yī)療糾紛案件常常受各方面因素影響導(dǎo)致尸檢不能及時進(jìn)行。尸體保存方法的不同和標(biāo)本的固定不良等造成組織自溶，致使器官組織的形態(tài)學(xué)特征不典型而影響傳統(tǒng)病理學(xué)觀察和法醫(yī)病理學(xué)家做出正確診斷。前期一系列研究已經(jīng)表明，DBI可因直接打擊、缺血缺氧等繼發(fā)性損傷、炎性介質(zhì)、

4、細(xì)胞因子及氧自由基等機(jī)制誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡。因此，深入研究DBI后生物分子標(biāo)志物的變化及其規(guī)律，對法醫(yī)學(xué)鑒定及臨床治療都有重大意義。
　　DBI生物分子標(biāo)志物的篩選是法醫(yī)學(xué)中的重點(diǎn)，已有研究表明DBI可激活內(nèi)源性保護(hù)因子和損害因子，如腦紅蛋白（neuroglobin，NGB）和β淀粉樣蛋白（Amyloid-βprotein，Aβ）及與它們相關(guān)的自由基。NGB是一種主要表達(dá)于脊椎動物腦組織的球蛋白，主要功能是參與氧在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的儲存

5、與轉(zhuǎn)運(yùn)，腦損傷對神經(jīng)元起著重要的保護(hù)作用。Aβ是β淀粉樣前體蛋白（beta amyloid precursor protein,β-APP）經(jīng)β分泌酶（beta-site amyloid precursor protein–cleaving enzyme1, BACE1）和γ分泌酶分解產(chǎn)生的37～43個氨基酸殘基組成的不同大小肽段，它主要通過氧化應(yīng)激和鈣超載兩個方面機(jī)制損害神經(jīng)元。目前研究表明，NGB不僅可以清除自由基以保護(hù)神經(jīng)元免受損

6、害，也可以削弱Aβ的毒性作用，從而對DBI后的神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。本課題研究利用改良的 Marmarou模型復(fù)制DBI模型，觀察DBI后腦干的病理變化，并檢測NGB和Aβ表達(dá)量的變化。通過研究實(shí)驗性大鼠DBI后腦干NGB和Aβ不同時間含量的變化規(guī)律，為法醫(yī)學(xué)中DBI的診斷、損傷評估及損傷時間地推斷提供重要的理論參考。
　　目的:
　　研究實(shí)驗性大鼠DBI后腦干Aβ和NGB不同時間點(diǎn)的表達(dá)水平及變化規(guī)律，初步探討Aβ及NGB兩

7、者聯(lián)合應(yīng)用作為DBI后腦干生物分子標(biāo)志物的可行性。
　　方法:
　　1.把成年健康的雌性Sprague Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分配為對照組和實(shí)驗組兩部分，其中實(shí)驗組又分為1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h組，每組大鼠10只。
　　2.參照改良的Marmarou自由落體撞擊方法復(fù)制DBI模型，先觀察打擊后大鼠的行為學(xué)變化，然后提取大鼠腦干組織，應(yīng)用蘇木精-伊紅染色法、勞克堅牢藍(lán)染色法及β-APP免疫組

8、織化學(xué)染色方法確定大鼠DBI模型建立成功；利用Aβ和NGB的免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察其形態(tài)學(xué)及陽性表達(dá)變化；腦干中 Aβ和 NGB的表達(dá)量通過 Western blotting進(jìn)行檢測，運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)對Aβ和NGB表達(dá)的共定位情況進(jìn)行觀察。
　　3.本實(shí)驗研究中所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析均用SPSS18.0軟件進(jìn)行處理，Mean±SEM表示該研究中的數(shù)據(jù)，運(yùn)用Office excel制作相關(guān)圖表，組間比較采用單因素方差分析（one-w

9、ay ANOVA），并且規(guī)定p＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.各時間點(diǎn)損傷組大鼠腦干的病理改變均與DBI形態(tài)學(xué)特征相符，觀察到神經(jīng)軸索明顯腫脹、呈串珠樣改變，3h組即可檢測到收縮球，傷后6h～72h，典型收縮球的范圍及數(shù)量逐漸增加。
　　2.免疫組化染色結(jié)果顯示DBI腦干1h組NGB和Aβ的表達(dá)量均升高；3h和6h組NGB表達(dá)量降低，Aβ的表達(dá)量持續(xù)升高，并且Aβ在6h表達(dá)量升高至第一個峰值；12h～7

10、2h之間，NGB的表達(dá)量呈波動性變化，24h組 Aβ的表達(dá)量出現(xiàn)第二個峰值。Aβ在1h、3h、6h、12h和72h這幾個時間組的表達(dá)量均高于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義；DBI1h、3h、12h、24h及48h組腦干NGB的表達(dá)量和對照組進(jìn)行比較，均具有顯著差異。
　　3.Western blotting檢測顯示DBI1h組腦干NGB的含量明顯升高至最大值，Aβ的含量也明顯升高；3h組NGB的表達(dá)量出現(xiàn)顯著回落，Aβ含量無明顯變化；6h

11、組NGB表達(dá)量繼續(xù)降低，Aβ表達(dá)量明顯升高，6h組表達(dá)量升高至第一個峰值；12h組NGB的表達(dá)量再次增加，Aβ出現(xiàn)降低；24h組NGB再一次出現(xiàn)降低，Aβ再次顯著地增加至第二個峰值；48 h和72h組腦干NGB表達(dá)量變化不顯著，Aβ表達(dá)量再次降低。
　　4.β-APP和Aβ在腦干神經(jīng)細(xì)胞胞漿及神經(jīng)軸索定位基本一致；Aβ和NGB在腦干神經(jīng)細(xì)胞胞漿定位一致，Aβ還特異性地表達(dá)于腦干組織細(xì)小血管周圍，NGB特異性的在腦干神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。<