甘蔗受黑穗病菌脅迫下microRNA差異表達(dá)及其靶基因功能分析.pdf

1、甘蔗（Saccharum spp.）是我國(guó)最重要的糖料作物和能源作物，蔗糖占我國(guó)食糖總產(chǎn)的92％。由黑粉菌（Sporisorium scitamineum，S.scitamineum）引起的甘蔗黑穗?。╯ugarcane smut），嚴(yán)重危害甘蔗生產(chǎn)，導(dǎo)致產(chǎn)量和蔗糖分降低，給我國(guó)甘蔗產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。培育抗黑穗病甘蔗品種是控制甘蔗黑穗病危害的最經(jīng)濟(jì)有效的手段。植物與病原互作的分子機(jī)制包括轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平、翻譯后水平

2、等多方面調(diào)控機(jī)制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)甘蔗與黑穗病菌互作分子機(jī)制的研究有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但是尚未見(jiàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定甘蔗受黑穗病菌脅迫后microRNA（miRNA）差異表達(dá)及其靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)和功能分析的報(bào)道。本研究首次利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定甘蔗受黑穗病菌脅迫下miRNA的差異表達(dá)，從甘蔗小RNA高通量測(cè)序與miRNA鑒定注釋、差異miRNA篩選和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）表達(dá)驗(yàn)證與表達(dá)模式分析、差異miRNA的功能分析

3、及其靶基因預(yù)測(cè)和靶基因表達(dá)分析等三個(gè)方面入手，系統(tǒng)比較了甘蔗與黑穗病菌互作系統(tǒng)的親和與不親和互作間在轉(zhuǎn)錄后水平上miRNA的調(diào)控機(jī)制，以期為甘蔗抗黑穗病分子機(jī)理的研究提供miRNA水平的佐證，豐富和深化甘蔗抗黑穗病的分子機(jī)理研究，進(jìn)而為培育抗黑穗病甘蔗品種提供miRNA水平的理論依據(jù)。
　　miRNA具有重要的生物學(xué)功能，在植物受到生物和非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控是生物體內(nèi)一條重要的小RNA調(diào)

4、控路徑。本研究以甘蔗抗黑穗病無(wú)性系崖城05-179（YA05-179）和感黑穗病甘蔗品種新臺(tái)糖22（ROC22）為研究材料，以接種黑穗病菌蔗芽作為處理組（YAT、RT），接種清水作為對(duì)照組（YACK、RCK），應(yīng)用高通量HiSeq測(cè)序技術(shù)鑒定甘蔗受黑穗病脅迫下48h的miRNA差異表達(dá)，對(duì)所獲得的小RNA序列注釋并篩選出差異表達(dá)的miRNA，利用生物信息學(xué)技術(shù)與數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合對(duì)其靶向基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選出的部分差異miRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量

5、驗(yàn)證，并進(jìn)一步分析了甘蔗與黑穗病菌互作0h、12h、48h和96h不同時(shí)間點(diǎn)miRNA與其部分靶基因的表達(dá)模式。研究旨在找到甘蔗在黑穗病菌脅迫下發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的miRNA及其靶基因，為甘蔗抗黑穗病分子育種提供miRNA和基因資源。主要研究結(jié)果如下：
　　1.四個(gè)甘蔗樣品的送樣質(zhì)量良好，分別測(cè)序得到符合要求的干凈序列為RCK36396588條、RT27812972條、YACK27464468條、YAT28290231條，且雜質(zhì)序列

6、含量都少于1%，故高通量測(cè)序獲得的小RNA質(zhì)量高。結(jié)合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)得的sRNAs進(jìn)行篩選注釋?zhuān)渲蠷CK測(cè)序獲得264個(gè)已知miRNA，RT有263個(gè)，YACK有260個(gè)，YAT有262個(gè)。此外，在RCK、RT、YACK和YAT中分別預(yù)測(cè)出137、140、111和119個(gè)新miRNA。有堿基分布統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，四個(gè)小RNA文庫(kù)中在植物中含量較多的長(zhǎng)度為21 nt和22 nt的新miRNA序列首位點(diǎn)堿基U所占比例較大；在序列堿基11位

7、點(diǎn)，四個(gè)樣品的新miRNA序列的堿基都偏向于A，符合miRNA序列特征，說(shuō)明新miRNA序列的預(yù)測(cè)結(jié)果可行性高。
　　2.在ROC22中，篩選出231個(gè)已知miRNA，其中35個(gè)在黑穗病菌脅迫處理樣品和清水接種對(duì)照樣品間發(fā)生顯著差異表達(dá)（|log2-ratio|>1，P<0.05）；涉及10個(gè)上調(diào)表達(dá)和25個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNA；在對(duì)照組與處理組樣品中表達(dá)量差異倍數(shù)最高達(dá)4.6倍。在YA05-179中，兩個(gè)樣品中共有的已知miRN

8、A為208個(gè)，對(duì)照組與處理組中發(fā)生顯著差異表達(dá)miRNA有11個(gè)；涉及2個(gè)上調(diào)表達(dá)和9個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNA；對(duì)照組與處理組樣品中表達(dá)量差異倍數(shù)最高達(dá)2.1倍。在ROC22和YA05-179中，篩選出的差異表達(dá)的已知miRNA，下調(diào)表達(dá)的占多數(shù)，且大部分miRNA的種類(lèi)和表達(dá)趨勢(shì)是相同的。在ROC22中，篩選出的顯著差異表達(dá)（|log2-ratio|>1，P<0.05）的新miRNA有16個(gè)，而YA05-179中有6個(gè)；其在單一品種特有

9、的比較多，且在兩個(gè)品種中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)共同顯著差異表達(dá)的新miRNA。本研究針對(duì)篩選出的16個(gè)差異表達(dá)的已知miRNA和新miRNA，利用qRT-PCR對(duì)其在ROC22與YA05-179兩個(gè)品種中27個(gè)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證，相符率達(dá)到了85.2%，可見(jiàn)本研究的測(cè)序結(jié)果可靠性較高。
　　3.甘蔗是個(gè)高度雜合的異源多倍非整倍體作物，其全基因組測(cè)序尚未完成，因此本研究注釋的miRNA未知序列占小RNA序列的絕大多數(shù)，隨后對(duì)所注釋的miRN

10、A在甘蔗受黑穗病菌脅迫時(shí)對(duì)應(yīng)靶基因的預(yù)測(cè)及分析數(shù)據(jù)也不完整。差異表達(dá)的已知miRNA預(yù)測(cè)出的靶基因數(shù)，YA05-179少于ROC22，但差異表達(dá)的新miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)目在YA05-179中明顯多于RO22。靶基因生物功能分析中，GO歸類(lèi)為生物過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組分和元件（cellular components）分子功能（molecular function）。兩個(gè)品種中，差異表達(dá)的已知miRNA靶基

11、因的分類(lèi)情況與差異表達(dá)的新miRNA所匹配的靶基因序列統(tǒng)計(jì)情況相似，即在生物過(guò)程分類(lèi)中靶基因主要分布在細(xì)胞過(guò)程與代謝過(guò)程，細(xì)胞組分和元件分類(lèi)中靶基因主要分布在細(xì)胞、細(xì)胞組分和細(xì)胞器中，分子功能分類(lèi)中靶基因主要分布在結(jié)合與催化活性。KEGG通路富集分析顯示，差異miRNA調(diào)控的靶基因參與了一系列miRNA調(diào)控靶基因生理生化途徑或抗病相關(guān)生理代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，表明甘蔗與黑穗病菌互作的分子機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，miR5077

12、、miR5671、miR5044、miR5261、miR5783、miR5221、miR6478和miR948的靶向基因在MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）和植物-病原菌互作（Plant-pathogen interaction）中發(fā)揮重要作用并構(gòu)建了相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。
　　4.從miRNA靶基因中篩選了在甘蔗E

13、ST文庫(kù)中有生物功能注釋的序列，并針對(duì)所篩選出的差異表達(dá)的已知miRNA和新miRNA所對(duì)應(yīng)的部分靶基因進(jìn)行了qRT-PCR表達(dá)分析。結(jié)果顯示，在已知miRNA與其靶基因的表達(dá)分析中，大部分miRNA與其靶基因呈負(fù)調(diào)控模式，即miRNA過(guò)表達(dá)時(shí)，靶基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；其中8個(gè)靶基因中有7個(gè)靶基因的表達(dá)在12h后基本相符，且在48h時(shí)匹配度最高。這也從另一方面說(shuō)明甘蔗受黑穗病菌脅迫后miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控作用在48h達(dá)到最高。研究還