HBV所致慢加急性肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中微小RNAs表達(dá)譜的變化.pdf

1、研究背景:microRNAs(miRNAs)是一類大小約為22nt的小的非編碼RNA分子,在動(dòng)物體內(nèi)大多數(shù)miRNA的生物合成過程是在RNA聚合酶II,核糖核酸內(nèi)切酶IIIDrosha及Dicer的作用下產(chǎn)生的。miRNA在生物界中廣泛存在。據(jù)推測(cè)動(dòng)物體內(nèi)大約1％--5%基因編碼miRNA,正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都可以表達(dá)某種特定的miRNA。組織細(xì)胞內(nèi)外的miRNA表達(dá)圖譜是不一樣的,miRNA可選擇性地從組織細(xì)胞釋放到外周血中,這種選擇

2、性機(jī)制及外周血miRNA的穩(wěn)定性有利于miRNA成為疾病診斷的生物標(biāo)志物。2008年Lawrie等在研究彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤病時(shí),在病人血清中首先檢測(cè)出miR-21[1].Li等首次將血清中miRNA作為生物標(biāo)志物,對(duì)HBV感染及HBV陽性的肝細(xì)胞癌(HCC)作出診斷。在他們研究中發(fā)現(xiàn)miR-375、miR-92a是HBV感染特有的,而miR-25、miR-375、let-7f可作為HBV陽性的肝細(xì)胞癌診斷的生物標(biāo)志物,且miR-375

3、的特異性為96%,敏感度為100%[2]。陳[3]等人在研究中發(fā)現(xiàn),HBV攜帶者與重型肝炎患者PBMC中差異性表達(dá)的miRNA共有17個(gè),其中hsa-miRNA-1246等5個(gè)表達(dá)上調(diào),hsa-miRNA-223,hsa-miRNA-547-3p,hsa-miRNA-150等12個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào),對(duì)這些差異性表達(dá)的miRNA初步分析,發(fā)現(xiàn)其中2個(gè)參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié),在12個(gè)低表達(dá)的miRNA中,miRNA-150和miRNA-223可

4、能與病毒性肝炎的肝細(xì)胞炎癥活動(dòng)有關(guān)。其中miRNA-150主要參與調(diào)控B淋巴細(xì)胞的成熟,還通過調(diào)節(jié)Th1與Th2細(xì)胞的分化參與機(jī)體炎癥反應(yīng)[4]。
　　目的:本研究旨在探尋在HBV所致的慢加急性肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生明顯改變的miRNAs,從中尋找與肝衰竭發(fā)生發(fā)展相關(guān)分子纖維蛋白原樣蛋白2/纖維介素(fibrinnogenlikeprotein2,fgl2),腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體(tumornecrosis

5、factorreceptor/tumornecrosisfactorreceptor,TNF/TNFR1),死亡受體CD95/死亡受體CD95配體(Fas/FasL),干擾素-γ(interferon-gamma,INF-γ)、干擾素-γ誘生蛋白-10(INF-γinducibleprotein-10,CXCL10)、Toll樣受體4(Toll-likereceptor4,TLR4)相互作用miRNAs,探求HBV所致的慢加急性肝衰竭疾

6、病的發(fā)生機(jī)制,從而為該疾病的診斷、治療、預(yù)防提供新思路。
　　方法:分別收集了20例HBV所致的慢加急性肝衰竭患者和慢乙肝輕度患者的外周血標(biāo)本,收集外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),利用miRNAmicroarray芯片,分析兩組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中miRNAs表達(dá)譜系的變化,尋找表達(dá)水平顯著改變(上調(diào)或下調(diào)超過2倍)的miRNA。同時(shí)又借助生物信息學(xué)靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件(TargetScan),找到與肝衰竭發(fā)生發(fā)展相關(guān)分子(h

7、fgl2,Fas/FasL、TNF/TNFR1、IFNγ、CXCL10、TLR4)相互作用miRNAs,對(duì)基因芯片的結(jié)果進(jìn)行初篩。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述芯片結(jié)果的可靠性,我們采用了GeneCopoeia公司的All-in-One?miRNAqRT-PCRDetectionKit對(duì)初篩的4種microRNA分子表達(dá)情況進(jìn)一步驗(yàn)證,U48是一種在各種細(xì)胞中表達(dá)較為穩(wěn)定的RNA,在本實(shí)驗(yàn)中作為內(nèi)參對(duì)照使用,所得的數(shù)據(jù)采用?ΔΔCT2方法進(jìn)行計(jì)算,

8、并對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:通過基因芯片并借助miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件(TargetScan),分析發(fā)現(xiàn)在HBV所致的慢加急性肝衰竭患者外周血混合單個(gè)核細(xì)胞中明顯下調(diào)的microRNA有16個(gè),其中,microRNA-181c、microRNA-30e、microRNA-1826、microRNA-107可能對(duì)肝衰竭發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子fgl2,Fas/FasL、TNF/TNFR1、IFNγ、CXCL10、TLR4起作