體外循環(huán)手術(shù)患者外周血單個核細(xì)胞蛋白表達(dá)的變化.pdf

1、體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)為手術(shù)或其他治療方法提供了有利條件,但也引起一系列術(shù)后并發(fā)癥,包括心、肺、腎功能的損傷,以及由炎癥因子失衡和免疫功能失調(diào)介導(dǎo)的復(fù)雜炎癥反應(yīng)。研究表明,CPB術(shù)后創(chuàng)傷反應(yīng)及并發(fā)癥是機體免疫功能失調(diào)所致。CPB結(jié)合其他因素誘導(dǎo)了機體復(fù)雜的體液、細(xì)胞炎性反應(yīng)。一方面,CPB引起補體激活、內(nèi)毒素釋放、粒細(xì)胞活化、黏附分子表達(dá)、致炎介質(zhì)釋放,表現(xiàn)為全身性、非特異性炎性反應(yīng)；另一方面,

2、通過產(chǎn)生抗炎介質(zhì),促使免疫細(xì)胞功能下降、凋亡,導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)的短暫失能,抑制炎性反應(yīng)。二者均是機體對CPB產(chǎn)生的正常保護性反應(yīng),對于減輕創(chuàng)傷、抵抗感染是至關(guān)重要的。大多數(shù)CPB手術(shù)病例,致炎、抗炎反應(yīng)系統(tǒng)相互制衡,保證機體平安度過圍手術(shù)期。如果失衡,大量炎性介質(zhì)入血,致炎性介質(zhì)級聯(lián)釋放,抗炎介質(zhì)不足以拮抗,即發(fā)生過度炎性反應(yīng)；相反,若抗炎介質(zhì)釋放過多,則產(chǎn)生免疫功能抑制,易繼發(fā)感染引起敗血癥等。炎性介質(zhì)或抗炎介質(zhì)由對機體的防御作用變?yōu)?/p>

3、破壞作用,最終致內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)態(tài)失衡,器官功能障礙。因此,對CPB手術(shù)中機體致炎/抗炎反應(yīng)調(diào)節(jié)機制的研究尤為重要。
　　 研究表明,體外循環(huán)后外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分泌一系列的細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng),但外周血單個核細(xì)胞參與這一過程的分子機制仍未完全明確。為了深入探討外周血單個核細(xì)胞參與炎癥的具體機制,我們采用了蛋白質(zhì)組學(xué)的思路和方法來進行進一步的研究。為臨床控制

4、體外循環(huán)后全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展提供重要的理論基礎(chǔ)。
　　 材料和方法
　　 1.臨床資料:
　　 選擇在我院行心臟瓣膜置換術(shù)的患者11例,男女不限,年齡20-60歲,ASAⅡ-Ⅲ級。在體外循環(huán)心臟停跳下手術(shù)。術(shù)前均無風(fēng)濕活動和其它免疫系統(tǒng)疾病。術(shù)前半年內(nèi)均未用免疫抑制劑。
　　 2.麻醉實施:
　　 麻醉前:入室后鼻導(dǎo)管吸氧2-5L/min,監(jiān)測5導(dǎo)聯(lián)ECG,SpO2,NIBP和BIS。局麻下建

5、立前臂靜脈通道、橈動脈置管監(jiān)測直接動脈壓、右頸內(nèi)靜脈穿刺置入3-lumen中心靜脈導(dǎo)管,建立CVP測壓并連接血管活性藥泵組。
　　 全麻誘導(dǎo):芬太尼4ug/kg,異丙酚2.0mg/kg,順式阿曲庫銨0.15mg/kg,氣管插管成功后吸入純氧+七氟烷2％-2.5％,調(diào)節(jié)七氟烷ET濃度在0.8-1.1MAC之間以維持BIS值在40-60區(qū)間,ETCO2在30-40mmHg。靜注嗎啡5-10mg。
　　 麻醉維持:切皮后增加七

6、氟烷吸入濃度以加深麻醉,劈胸骨前3-5min補注芬太尼3-4ug/kg。胸腔操作及心臟、主動脈插管期間根據(jù)血流動力學(xué)的變化調(diào)整麻醉深度。體外循環(huán)開始后關(guān)閉七氟烷并間斷補注嗎啡和順式阿曲庫銨。給予異丙酚(1.0mg/kg)一次靜注后繼以異丙酚(100ug/kg*min)持續(xù)輸注,直至術(shù)畢。手術(shù)全程連續(xù)監(jiān)測心電圖、脈氧飽和度、橈動脈壓、CVP、鼻咽溫、尿量,定時查動脈血氣。體外循環(huán)期間根據(jù)血氣分析的結(jié)果和尿量,視情況給與碳酸氫鈉、甘露醇、速

7、尿、氯化鉀、氯化鈣等。根據(jù)公式及患者的體重計算預(yù)充液的用量,使病人的Hct維持在20％～28％之間。
　　 麻醉后:術(shù)畢以異丙酚(50ug/kg min)持續(xù)輸注鎮(zhèn)靜,送入ICU行機械通氣。
　　 3.手術(shù)方法:
　　 在體外循環(huán)下阻斷升主動脈,在心臟停跳下手術(shù),鼻咽溫度25-28℃,每間隔30min用Thomas液經(jīng)主動脈根部灌注1次,心包腔內(nèi)置冰屑,復(fù)跳后輔助循環(huán)時間為阻斷時間的1/3。
　　 4.標(biāo)

8、本的采集與處理
　　 患者分別于麻醉后手術(shù)前(T0)、轉(zhuǎn)機后1h(T1)和手術(shù)結(jié)束時(T2)三個時點抽取動脈血3-5ml,肝素鈉抗凝,常溫下送實驗室,取3ml血樣用單個核細(xì)胞分離液按密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。隨后將分離的外周血單個核細(xì)胞進行裂解,獲取蛋白,并將蛋白進行2-DE分離。利用UMAXPowerLook 1100透射掃描儀獲取圖像,用PDQuest 7.1.0軟件包進行圖像分析,選取差異蛋白質(zhì)點。將

9、差異點挖出,處理后送入質(zhì)譜,按照4000Series ExplorerSoftware軟件操作,打擊樣品獲得MS和MS/MS圖譜,搜素SwissProt數(shù)據(jù)庫,解析蛋白序列,分析可能參與炎癥反應(yīng)的單個核細(xì)胞分泌的磷酸化蛋白。對與有意義的差異磷酸化蛋白,采用Western blot進行進一步驗證。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)方法:
　　 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,統(tǒng)計學(xué)處理采用ANOVO Test,所有統(tǒng)計分析均采用SP

10、SS13.0軟件進行處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 根據(jù)差異蛋白質(zhì)點的選取標(biāo)準(zhǔn):麻醉后手術(shù)前(T0)、體外循環(huán)開始后1h(T1)和手術(shù)結(jié)束時(T2)三時點蛋白表達(dá)存在顯著不同。分析2-DE分離得到的差異點,獲得有效鑒定的蛋白12種,其中4個蛋白表達(dá)量在T1組達(dá)到高峰,后開始下降。5個蛋白在T0組表達(dá)量最高,T1組表達(dá)量最低；1個蛋白隨著手術(shù)的進行表達(dá)量逐漸降低；2個蛋白隨著手術(shù)的進行表達(dá)量逐漸升

11、高。獲得的12個差異蛋白質(zhì)譜(MALDI-TOF MS/MS質(zhì)譜分析)鑒定全部成功。其中S100A9是由外周血單個核細(xì)胞分泌的,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。S100A9的表達(dá)量在T1組達(dá)到高峰,T2組開始下降,但仍高于T0組(One-Way ANOVO,F=371.174,P=0.000)
　　 結(jié)論
　　 1)體外循環(huán)可誘導(dǎo)外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生多種蛋白參與急性炎癥反應(yīng)。
　　 2)S100A9表達(dá)量在體外循環(huán)開始