APC-Cdh1在神經(jīng)病理性疼痛大鼠前扣帶回皮層可塑性變化中的作用.pdf

1、背景和目的：神經(jīng)病理性疼痛是慢性難治性疼痛的常見類型，主要由中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病所引起，表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏。中樞敏化是神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生的基礎(chǔ)，前扣帶回皮層（anterior cingulate cortex，ACC）作為與慢性疼痛相關(guān)的關(guān)鍵腦區(qū)，其可塑性變化是中樞敏化的重要體現(xiàn)。細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物（anaphase promoting complex，APC）與其調(diào)節(jié)亞基Cdh1是細(xì)胞內(nèi)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)

2、中重要的E3泛素連接酶，最近研究顯示其在谷氨酸敏感性、突觸功能及神經(jīng)元存活的調(diào)控中起著重要作用。但其是否參與神經(jīng)病理性疼痛 AC C可塑性機(jī)制，尚不清楚。
　　本研究擬觀察神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC區(qū)APC-Cdh1及其下游底物的表達(dá)變化規(guī)律。通過構(gòu)建表達(dá)Cdh1基因的重組慢病毒載體，上調(diào)該腦區(qū)APC-Cdh1活性。分別從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及分子水平觀察慢病毒干預(yù)對(duì)ACC谷氨酸受體密度、突觸形態(tài)功能及神經(jīng)元存活的影響和機(jī)制，探討APC-

3、Cdh1在神經(jīng)病理性疼痛ACC可塑性變化中的作用。
　　方法與結(jié)果：
　　1.神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC區(qū)APC-Cdh1表達(dá)變化與痛覺超敏的關(guān)系
　　方法：實(shí)驗(yàn)一（神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC區(qū)APC-Cdh1的表達(dá)變化）：雄性SD大鼠48只，體重180-220g，隨機(jī)分為2組（n=24）。1)假手術(shù)組（Sham組）：僅暴露坐骨神經(jīng)及其分支；2)神經(jīng)病理性疼痛模型組（SNI組）：參照Decosterd等方法，選擇性損傷坐骨

4、神經(jīng)其下分支中的脛神經(jīng)及腓總神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)，建立大鼠坐骨神經(jīng)保留性損傷（spared nerve injury，SNI）模型。通過觀察模型大鼠痛覺行為學(xué)變化，免疫組化檢測(cè)大鼠 ACC疼痛相關(guān)蛋白c-Fos的表達(dá)，證實(shí)模型構(gòu)建成功。模型建立后3、7、14 d，采用免疫組化及Western blot法檢測(cè)兩組大鼠ACC區(qū)APC-Cdh1、下游底物Skp2、SnoN及其上游調(diào)節(jié)激酶Cdk5/p35的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二（ACC立體定位

5、注射Cdh1過表達(dá)慢病毒對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛閾的影響）：參照大鼠腦立體定位圖譜（Paxinoset al.,2005），確定ACC坐標(biāo)，分別將Cdh1過表達(dá)慢病毒（Lenti-Cdh1）及對(duì)照慢病毒（Lenti-control）通過立體定向注射入大鼠ACC（10μl，滴度2×108TU/ml）。慢病毒感染后3d，快速斷頭取腦，避光制作冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察ACC綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)；分離ACC，提取總蛋白，Western

6、blot法檢測(cè)Cdh1外源性融合蛋白的表達(dá)，評(píng)價(jià)各型慢病毒在體感染情況。18只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為1)Sham+ saline組：假手術(shù)后7d，ACC立體定位注射0.9％氯化鈉溶液（n=6）；2)SNI+ Lenti-control組：SNI模型建立后7d，ACC立體定位注射Lenti-control（n=6）；3)SNI+ Lenti-Cdh1組：SNI模型建立后7d，ACC立體定位注射Lenti-Cdh1（n=6）。模型建立前至慢

7、病毒感染后14d采用von Frey細(xì)絲法測(cè)定三組大鼠機(jī)械痛閾的變化。
　　結(jié)果：術(shù)后1、3、7、14d，SNI組50%機(jī)械性縮爪閾值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）顯著下降，與Sham組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化檢測(cè)顯示，SNI組術(shù)后3、7、14d，ACC疼痛相關(guān)蛋白c-Fos表達(dá)明顯增加，從組織學(xué)上進(jìn)一步證明了SNI模型構(gòu)建的成功。免疫組化、Weste

8、rn blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SNI大鼠術(shù)后3、7、14d，ACC區(qū)Cdh1總蛋白及APC主要成分APC2表達(dá)減少，且部分Cdh1出核轉(zhuǎn)入細(xì)胞漿表達(dá)；Cd h1下游底物Skp2、S noN表達(dá)升高，上游負(fù)性調(diào)節(jié)激酶Cdk5/p35表達(dá)明顯增加，與Sham組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P<0.05）。Cdh1過表達(dá)慢病毒Lenti-Cdh1 ACC內(nèi)立體定位注射，上調(diào)APC-Cdh1活性可部分緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛痛覺超敏，與對(duì)照慢病毒Lenti-c

9、ontrol相比，SNI+Lenti-Cdh1組慢病毒注射后7d50%PWMT上升，并持續(xù)至慢病毒注射后14d，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P<0.05）。
　　2.APC-Cdh1活性調(diào)節(jié)對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠ACC神經(jīng)元突觸可塑性的影響及機(jī)制方法：實(shí)驗(yàn)一（神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC突觸可塑性變化）：成年雄性SD大鼠54只，隨機(jī)分為2組。1)Sham組：僅暴露坐骨神經(jīng)及其分支（n=27）；2)SNI組：結(jié)扎并切斷左側(cè)脛神經(jīng)及腓總神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)

10、（n=27）。術(shù)后3、7、14d，紫外比色法測(cè)定大鼠ACC內(nèi)興奮性氨基酸谷氨酸的含量，免疫熒光法檢測(cè)突觸功能蛋白的表達(dá)變化，并分別提取ACC總蛋白及膜蛋白，Western blot法分析檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)突觸后各型谷氨酸受體的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)二（APC-Cdh1與神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC神經(jīng)元突觸可塑性變化的關(guān)系）：30只成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為Sham組（n=15）和SNI組（n=15），參照Decosterd等方法，選擇性損

11、傷坐骨神經(jīng)分支，建立大鼠神經(jīng)病理性疼痛SNI模型。分別于模型建立后3、7d，采用免疫熒光和Western blot法檢測(cè)SNI模型大鼠ACC區(qū)Cdh1相關(guān)蛋白EphA4的表達(dá)特點(diǎn)。并于術(shù)后第14d，利用免疫共沉淀技術(shù)，觀察Cdh1相關(guān)蛋白EphA4與APC-Cdh1及各型谷氨酸受體之間的相互作用。
　　實(shí)驗(yàn)三（慢病毒過表達(dá)Cdh1蛋白對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC神經(jīng)元突觸可塑性的影響）：成年雄性SD大鼠24只，建立SNI神經(jīng)病理性疼

12、痛模型，隨機(jī)分為Sham組（n=6）、SNI組（n=6）、SNI+Lenti-control組（n=6）和SNI+ Lenti-Cdh1組（n=6）。SNI+Lenti-control組及SNI+Lenti-Cdh1組于模型建立后7d分別將Lenti-control及Lenti-Cdh1慢病毒通過立體定向注射入大鼠ACC（10μl，滴度2×108TU/ml）。慢病毒注射后14d，透射電鏡觀察大鼠ACC突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。給予慢病毒后3、

13、7、14d，Western blot檢測(cè)ACC突觸功能蛋白PSD95、Cdh1相關(guān)蛋白EphA4及谷氨酸受體GluR1的水平，評(píng)價(jià)APC-Cdh1活性調(diào)節(jié)對(duì)ACC突觸可塑性的影響。
　　結(jié)果：術(shù)后3、7、14d，SNI組大鼠ACC內(nèi)谷氨酸含量，突觸功能蛋白突觸素Syn1、PSD95及NMDA受體NR2B亞型的表達(dá)，與Sham組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；GluR1-AMPA受體總表達(dá)量，兩組間無明顯差異（P>0

14、.05），但其胞膜表達(dá)量顯著增加，與Sham組相比，差異顯著（P<0.05）。Western blot和免疫熒光染色顯示，SNI術(shù)后3、7d，與Sham組相比，SNI組ACC區(qū)APC-Cdh1相關(guān)蛋白EphA4表達(dá)降低（P<0.05）。免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EphA4與Cdh1、APC主要成分APC2及谷氨酸受體GluR1間存在相互作用。與Sham組相比，SNI組大鼠ACC線粒體腫脹、突觸后致密物增厚，突觸間隙變窄。而ACC內(nèi)立體定位注射

15、Cdh1過表達(dá)慢病毒Lenti-Cdh1可逆轉(zhuǎn)上述SNI導(dǎo)致的突觸結(jié)構(gòu)的改變。SNI+Lenti-Cdh1組慢病毒注射后7、14d，ACC內(nèi)EphA4表達(dá)升高，PSD95及GluR1表達(dá)明顯減少，與SNI+Lenti-contro l組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.ACC神經(jīng)元存活與神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛覺超敏的關(guān)系
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一（神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC神經(jīng)元凋亡及存活的變化）：SD雄性

16、大鼠24只，體重180-220g，隨機(jī)分為Sham組（n=12）及SNI組（n=12）。術(shù)后3、10d采用神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN標(biāo)記神經(jīng)元，通過免疫熒光和Western blot法檢測(cè)ACC神經(jīng)元的變化，并利用TUNEL技術(shù)及active caspase-3（Casp-3a）/NeuN免疫熒光雙標(biāo)染色觀察模型建立后10 d大鼠ACC神經(jīng)元的凋亡情況。
　　實(shí)驗(yàn)二（凋亡抑制劑TUDCA對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC神經(jīng)元存活及痛閾的

17、影響）：36只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為3組（n=12）。1)Sham組：僅暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)及其分支；2) SNI+saline組：SNI術(shù)前3d至術(shù)后隔日腹腔注射0.9%氯化鈉溶液；3)SNI+ TUDCA組：SNI術(shù)前3d至術(shù)后隔日腹腔注射TUDCA（300mg/kg）。采用von Frey細(xì)絲法測(cè)定3組大鼠50% PWMT，評(píng)價(jià)痛覺行為學(xué)變化。術(shù)后10d，NeuN標(biāo)記神經(jīng)元，谷氨酸脫羧酶65/67（GAD65/67）標(biāo)記GABA能抑制

18、性神經(jīng)元，免疫熒光及Western blot法檢測(cè)ACC神經(jīng)元的變化，并利用TUNEL染色觀察神經(jīng)元的凋亡情況。
　　結(jié)果：SNI組大鼠術(shù)后10dACC神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，與Sham組相比，差異顯著（P<0.05），且殘存神經(jīng)元排列松散，TUNEL染色可見大量凋亡細(xì)胞。Casp-3a/NeuN熒光雙標(biāo)檢測(cè)顯示，SNI術(shù)后10d，大鼠ACC內(nèi)表達(dá)Casp-3a的神經(jīng)元明顯增多。術(shù)后4d，SNI+TUDCA組大鼠較SNI+saline

19、組，50% PWMT明顯升高，持續(xù)至術(shù)后10d，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與SNI+saline相比，SNI+TUDCA組ACC神經(jīng)元數(shù)量顯著增多（P<0.05），且TUNEL陽性凋亡細(xì)胞明顯減少。免疫熒光、Western blot結(jié)果顯示，SNI術(shù)后大鼠ACC內(nèi)GAD65及GAD67蛋白表達(dá)降低；而TUDCA可抑制上述SNI相關(guān)的GAD蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。
　　4.APC-Cdh1活性調(diào)節(jié)對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠

20、ACC神經(jīng)元存活影響的初步研究方法：實(shí)驗(yàn)一（神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC凋亡相關(guān)底物Cyclin B1的表達(dá)變化）：成年雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為Sham（n=12）、SNI（n=12）兩組。Sham及SNI神經(jīng)病理性疼痛模型建立后10d，分別采用免疫熒光及Western blot法檢測(cè)兩組大鼠ACC內(nèi)APC-Cdh1凋亡相關(guān)底物Cyclin B1的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二（慢病毒過表達(dá)Cdh1蛋白對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC神經(jīng)元凋亡的影

21、響）：36只成年雄性SD大鼠，180-220g，隨機(jī)分為Sham組（n=12）、SNI+Lenti-control組（n=12）及SNI+Lenti-Cdh1組（n=12）。后兩組大鼠SNI模型建立前3d，ACC分別立體定位注射Lenti-control及Leni-Cdh1慢病毒載體。SNI術(shù)后10d，TUNEL染色觀察ACC神經(jīng)元凋亡情況，Western blot檢測(cè)Casp-3a及APC-Cdh1凋亡相關(guān)底物Cyclin B1的表達(dá)

22、。
　　結(jié)果：免疫熒光、Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型建立后10d，SNI組ACC內(nèi)APC-Cdh1凋亡相關(guān)底物Cyclin B1表達(dá)與Sham組相比，明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而Cdh1過表達(dá)慢病毒Lenti-Cdh1注射入ACC，上調(diào)其內(nèi)APC-Cdh1活性，可降低凋亡相關(guān)底物Cyclin B1的表達(dá)；抑制SNI引起的ACC神經(jīng)元凋亡，與對(duì)照慢病毒組相比，SNI+Lenti-Cdh1組大鼠ACC內(nèi)

23、TUNEL陽性凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，Casp-3a蛋白表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC內(nèi)APC-Cdh1活性下調(diào)，通過Cdh1過表達(dá)慢病毒上調(diào)其活性，可以部分緩解大鼠

24、神經(jīng)病理性疼痛。
　　2.APC-Cdh1可通過與EphA4相互作用泛素化降解突觸后AMPA受體亞基GluR1，調(diào)控谷氨酸興奮性突觸信號(hào)傳遞，參與神經(jīng)病理性疼痛ACC中樞敏化的形成。
　　3.ACC內(nèi)GABA能神經(jīng)元凋亡與神經(jīng)病理性疼痛痛覺超敏的維持密切相關(guān)，Caspase-3通路介導(dǎo)的GABA能神經(jīng)元凋亡丟失是ACC可塑性改變的重要體現(xiàn)。
　　4.APC-Cdh1可能通過作用于底物蛋白Cyclin B1，調(diào)控神經(jīng)病理