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文檔簡(jiǎn)介
1、背景和目的:神經(jīng)病理性疼痛是慢性難治性疼痛的常見類型,主要由中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病所引起,表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏和痛覺(jué)超敏。中樞敏化是神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生的基礎(chǔ),前扣帶回皮層(anterior cingulate cortex,ACC)作為與慢性疼痛相關(guān)的關(guān)鍵腦區(qū),其可塑性變化是中樞敏化的重要體現(xiàn)。細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex,APC)與其調(diào)節(jié)亞基Cdh1是細(xì)胞內(nèi)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)
2、中重要的E3泛素連接酶,最近研究顯示其在谷氨酸敏感性、突觸功能及神經(jīng)元存活的調(diào)控中起著重要作用。但其是否參與神經(jīng)病理性疼痛 AC C可塑性機(jī)制,尚不清楚。
本研究擬觀察神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC區(qū)APC-Cdh1及其下游底物的表達(dá)變化規(guī)律。通過(guò)構(gòu)建表達(dá)Cdh1基因的重組慢病毒載體,上調(diào)該腦區(qū)APC-Cdh1活性。分別從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及分子水平觀察慢病毒干預(yù)對(duì)ACC谷氨酸受體密度、突觸形態(tài)功能及神經(jīng)元存活的影響和機(jī)制,探討APC-
3、Cdh1在神經(jīng)病理性疼痛ACC可塑性變化中的作用。
方法與結(jié)果:
1.神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC區(qū)APC-Cdh1表達(dá)變化與痛覺(jué)超敏的關(guān)系
方法:實(shí)驗(yàn)一(神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC區(qū)APC-Cdh1的表達(dá)變化):雄性SD大鼠48只,體重180-220g,隨機(jī)分為2組(n=24)。1)假手術(shù)組(Sham組):僅暴露坐骨神經(jīng)及其分支;2)神經(jīng)病理性疼痛模型組(SNI組):參照Decosterd等方法,選擇性損傷坐骨
4、神經(jīng)其下分支中的脛神經(jīng)及腓總神經(jīng),保留腓腸神經(jīng),建立大鼠坐骨神經(jīng)保留性損傷(spared nerve injury,SNI)模型。通過(guò)觀察模型大鼠痛覺(jué)行為學(xué)變化,免疫組化檢測(cè)大鼠 ACC疼痛相關(guān)蛋白c-Fos的表達(dá),證實(shí)模型構(gòu)建成功。模型建立后3、7、14 d,采用免疫組化及Western blot法檢測(cè)兩組大鼠ACC區(qū)APC-Cdh1、下游底物Skp2、SnoN及其上游調(diào)節(jié)激酶Cdk5/p35的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)二(ACC立體定位
5、注射Cdh1過(guò)表達(dá)慢病毒對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛閾的影響):參照大鼠腦立體定位圖譜(Paxinoset al.,2005),確定ACC坐標(biāo),分別將Cdh1過(guò)表達(dá)慢病毒(Lenti-Cdh1)及對(duì)照慢病毒(Lenti-control)通過(guò)立體定向注射入大鼠ACC(10μl,滴度2×108TU/ml)。慢病毒感染后3d,快速斷頭取腦,避光制作冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察ACC綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá);分離ACC,提取總蛋白,Western
6、blot法檢測(cè)Cdh1外源性融合蛋白的表達(dá),評(píng)價(jià)各型慢病毒在體感染情況。18只雄性SD大鼠,隨機(jī)分為1)Sham+ saline組:假手術(shù)后7d,ACC立體定位注射0.9%氯化鈉溶液(n=6);2)SNI+ Lenti-control組:SNI模型建立后7d,ACC立體定位注射Lenti-control(n=6);3)SNI+ Lenti-Cdh1組:SNI模型建立后7d,ACC立體定位注射Lenti-Cdh1(n=6)。模型建立前至慢
7、病毒感染后14d采用von Frey細(xì)絲法測(cè)定三組大鼠機(jī)械痛閾的變化。
結(jié)果:術(shù)后1、3、7、14d,SNI組50%機(jī)械性縮爪閾值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)顯著下降,與Sham組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化檢測(cè)顯示,SNI組術(shù)后3、7、14d,ACC疼痛相關(guān)蛋白c-Fos表達(dá)明顯增加,從組織學(xué)上進(jìn)一步證明了SNI模型構(gòu)建的成功。免疫組化、Weste
8、rn blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SNI大鼠術(shù)后3、7、14d,ACC區(qū)Cdh1總蛋白及APC主要成分APC2表達(dá)減少,且部分Cdh1出核轉(zhuǎn)入細(xì)胞漿表達(dá);Cd h1下游底物Skp2、S noN表達(dá)升高,上游負(fù)性調(diào)節(jié)激酶Cdk5/p35表達(dá)明顯增加,與Sham組比較,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)。Cdh1過(guò)表達(dá)慢病毒Lenti-Cdh1 ACC內(nèi)立體定位注射,上調(diào)APC-Cdh1活性可部分緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛痛覺(jué)超敏,與對(duì)照慢病毒Lenti-c
9、ontrol相比,SNI+Lenti-Cdh1組慢病毒注射后7d50%PWMT上升,并持續(xù)至慢病毒注射后14d,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P<0.05)。
2.APC-Cdh1活性調(diào)節(jié)對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠ACC神經(jīng)元突觸可塑性的影響及機(jī)制方法:實(shí)驗(yàn)一(神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC突觸可塑性變化):成年雄性SD大鼠54只,隨機(jī)分為2組。1)Sham組:僅暴露坐骨神經(jīng)及其分支(n=27);2)SNI組:結(jié)扎并切斷左側(cè)脛神經(jīng)及腓總神經(jīng),保留腓腸神經(jīng)
10、(n=27)。術(shù)后3、7、14d,紫外比色法測(cè)定大鼠ACC內(nèi)興奮性氨基酸谷氨酸的含量,免疫熒光法檢測(cè)突觸功能蛋白的表達(dá)變化,并分別提取ACC總蛋白及膜蛋白,Western blot法分析檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)突觸后各型谷氨酸受體的表達(dá)情況。
實(shí)驗(yàn)二(APC-Cdh1與神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC神經(jīng)元突觸可塑性變化的關(guān)系):30只成年雄性SD大鼠,隨機(jī)分為Sham組(n=15)和SNI組(n=15),參照Decosterd等方法,選擇性損
11、傷坐骨神經(jīng)分支,建立大鼠神經(jīng)病理性疼痛SNI模型。分別于模型建立后3、7d,采用免疫熒光和Western blot法檢測(cè)SNI模型大鼠ACC區(qū)Cdh1相關(guān)蛋白EphA4的表達(dá)特點(diǎn)。并于術(shù)后第14d,利用免疫共沉淀技術(shù),觀察Cdh1相關(guān)蛋白EphA4與APC-Cdh1及各型谷氨酸受體之間的相互作用。
實(shí)驗(yàn)三(慢病毒過(guò)表達(dá)Cdh1蛋白對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC神經(jīng)元突觸可塑性的影響):成年雄性SD大鼠24只,建立SNI神經(jīng)病理性疼
12、痛模型,隨機(jī)分為Sham組(n=6)、SNI組(n=6)、SNI+Lenti-control組(n=6)和SNI+ Lenti-Cdh1組(n=6)。SNI+Lenti-control組及SNI+Lenti-Cdh1組于模型建立后7d分別將Lenti-control及Lenti-Cdh1慢病毒通過(guò)立體定向注射入大鼠ACC(10μl,滴度2×108TU/ml)。慢病毒注射后14d,透射電鏡觀察大鼠ACC突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。給予慢病毒后3、
13、7、14d,Western blot檢測(cè)ACC突觸功能蛋白PSD95、Cdh1相關(guān)蛋白EphA4及谷氨酸受體GluR1的水平,評(píng)價(jià)APC-Cdh1活性調(diào)節(jié)對(duì)ACC突觸可塑性的影響。
結(jié)果:術(shù)后3、7、14d,SNI組大鼠ACC內(nèi)谷氨酸含量,突觸功能蛋白突觸素Syn1、PSD95及NMDA受體NR2B亞型的表達(dá),與Sham組相比明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);GluR1-AMPA受體總表達(dá)量,兩組間無(wú)明顯差異(P>0
14、.05),但其胞膜表達(dá)量顯著增加,與Sham組相比,差異顯著(P<0.05)。Western blot和免疫熒光染色顯示,SNI術(shù)后3、7d,與Sham組相比,SNI組ACC區(qū)APC-Cdh1相關(guān)蛋白EphA4表達(dá)降低(P<0.05)。免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),EphA4與Cdh1、APC主要成分APC2及谷氨酸受體GluR1間存在相互作用。與Sham組相比,SNI組大鼠ACC線粒體腫脹、突觸后致密物增厚,突觸間隙變窄。而ACC內(nèi)立體定位注射
15、Cdh1過(guò)表達(dá)慢病毒Lenti-Cdh1可逆轉(zhuǎn)上述SNI導(dǎo)致的突觸結(jié)構(gòu)的改變。SNI+Lenti-Cdh1組慢病毒注射后7、14d,ACC內(nèi)EphA4表達(dá)升高,PSD95及GluR1表達(dá)明顯減少,與SNI+Lenti-contro l組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3.ACC神經(jīng)元存活與神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛覺(jué)超敏的關(guān)系
方法:
實(shí)驗(yàn)一(神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC神經(jīng)元凋亡及存活的變化):SD雄性
16、大鼠24只,體重180-220g,隨機(jī)分為Sham組(n=12)及SNI組(n=12)。術(shù)后3、10d采用神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN標(biāo)記神經(jīng)元,通過(guò)免疫熒光和Western blot法檢測(cè)ACC神經(jīng)元的變化,并利用TUNEL技術(shù)及active caspase-3(Casp-3a)/NeuN免疫熒光雙標(biāo)染色觀察模型建立后10 d大鼠ACC神經(jīng)元的凋亡情況。
實(shí)驗(yàn)二(凋亡抑制劑TUDCA對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC神經(jīng)元存活及痛閾的
17、影響):36只SD雄性大鼠,隨機(jī)分為3組(n=12)。1)Sham組:僅暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)及其分支;2) SNI+saline組:SNI術(shù)前3d至術(shù)后隔日腹腔注射0.9%氯化鈉溶液;3)SNI+ TUDCA組:SNI術(shù)前3d至術(shù)后隔日腹腔注射TUDCA(300mg/kg)。采用von Frey細(xì)絲法測(cè)定3組大鼠50% PWMT,評(píng)價(jià)痛覺(jué)行為學(xué)變化。術(shù)后10d,NeuN標(biāo)記神經(jīng)元,谷氨酸脫羧酶65/67(GAD65/67)標(biāo)記GABA能抑制
18、性神經(jīng)元,免疫熒光及Western blot法檢測(cè)ACC神經(jīng)元的變化,并利用TUNEL染色觀察神經(jīng)元的凋亡情況。
結(jié)果:SNI組大鼠術(shù)后10dACC神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,與Sham組相比,差異顯著(P<0.05),且殘存神經(jīng)元排列松散,TUNEL染色可見大量凋亡細(xì)胞。Casp-3a/NeuN熒光雙標(biāo)檢測(cè)顯示,SNI術(shù)后10d,大鼠ACC內(nèi)表達(dá)Casp-3a的神經(jīng)元明顯增多。術(shù)后4d,SNI+TUDCA組大鼠較SNI+saline
19、組,50% PWMT明顯升高,持續(xù)至術(shù)后10d,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與SNI+saline相比,SNI+TUDCA組ACC神經(jīng)元數(shù)量顯著增多(P<0.05),且TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞明顯減少。免疫熒光、Western blot結(jié)果顯示,SNI術(shù)后大鼠ACC內(nèi)GAD65及GAD67蛋白表達(dá)降低;而TUDCA可抑制上述SNI相關(guān)的GAD蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。
4.APC-Cdh1活性調(diào)節(jié)對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠
20、ACC神經(jīng)元存活影響的初步研究方法:實(shí)驗(yàn)一(神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC凋亡相關(guān)底物Cyclin B1的表達(dá)變化):成年雄性SD大鼠24只,隨機(jī)分為Sham(n=12)、SNI(n=12)兩組。Sham及SNI神經(jīng)病理性疼痛模型建立后10d,分別采用免疫熒光及Western blot法檢測(cè)兩組大鼠ACC內(nèi)APC-Cdh1凋亡相關(guān)底物Cyclin B1的表達(dá)。
實(shí)驗(yàn)二(慢病毒過(guò)表達(dá)Cdh1蛋白對(duì)神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC神經(jīng)元凋亡的影
21、響):36只成年雄性SD大鼠,180-220g,隨機(jī)分為Sham組(n=12)、SNI+Lenti-control組(n=12)及SNI+Lenti-Cdh1組(n=12)。后兩組大鼠SNI模型建立前3d,ACC分別立體定位注射Lenti-control及Leni-Cdh1慢病毒載體。SNI術(shù)后10d,TUNEL染色觀察ACC神經(jīng)元凋亡情況,Western blot檢測(cè)Casp-3a及APC-Cdh1凋亡相關(guān)底物Cyclin B1的表達(dá)
22、。
結(jié)果:免疫熒光、Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),模型建立后10d,SNI組ACC內(nèi)APC-Cdh1凋亡相關(guān)底物Cyclin B1表達(dá)與Sham組相比,明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而Cdh1過(guò)表達(dá)慢病毒Lenti-Cdh1注射入ACC,上調(diào)其內(nèi)APC-Cdh1活性,可降低凋亡相關(guān)底物Cyclin B1的表達(dá);抑制SNI引起的ACC神經(jīng)元凋亡,與對(duì)照慢病毒組相比,SNI+Lenti-Cdh1組大鼠ACC內(nèi)
23、TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少,Casp-3a蛋白表達(dá)顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
1.神經(jīng)病理性疼痛大鼠ACC內(nèi)APC-Cdh1活性下調(diào),通過(guò)Cdh1過(guò)表達(dá)慢病毒上調(diào)其活性,可以部分緩解大鼠
24、神經(jīng)病理性疼痛。
2.APC-Cdh1可通過(guò)與EphA4相互作用泛素化降解突觸后AMPA受體亞基GluR1,調(diào)控谷氨酸興奮性突觸信號(hào)傳遞,參與神經(jīng)病理性疼痛ACC中樞敏化的形成。
3.ACC內(nèi)GABA能神經(jīng)元凋亡與神經(jīng)病理性疼痛痛覺(jué)超敏的維持密切相關(guān),Caspase-3通路介導(dǎo)的GABA能神經(jīng)元凋亡丟失是ACC可塑性改變的重要體現(xiàn)。
4.APC-Cdh1可能通過(guò)作用于底物蛋白Cyclin B1,調(diào)控神經(jīng)病理
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