DRG局部GABA系統(tǒng)在神經(jīng)病理性疼痛中的作用.pdf

1、軀體感覺(jué)神經(jīng)元是機(jī)體感覺(jué)系統(tǒng)的重要組成部分，其胞體存在于背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion,DRG），DRG神經(jīng)元外周軸突末梢可感受各種各樣的外周刺激例如溫度刺激、化學(xué)刺激和機(jī)械刺激等，并將其轉(zhuǎn)化為神經(jīng)沖動(dòng)向中樞傳遞，從而形成溫度覺(jué)、痛覺(jué)和觸覺(jué)等感覺(jué)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)DRG神經(jīng)元不僅具有痛覺(jué)信號(hào)形成和傳遞作用，而且還兼具痛覺(jué)信號(hào)調(diào)節(jié)作用。DRG局部存在功能性的GABA回路系統(tǒng)，DRG組織和培養(yǎng)細(xì)胞在多種興奮性刺激作用

2、下可有GABA釋放，DRG局部應(yīng)用GABA對(duì)緩激肽誘發(fā)的急性炎性疼痛有顯著的抑制作用。這些均提示DRG部位（特別是該部位的GABA系統(tǒng)）可能作為疼痛治療的潛在靶點(diǎn)。慢性神經(jīng)病理性疼痛是臨床常見(jiàn)疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前臨床針對(duì)慢性神經(jīng)病理性疼痛尚缺乏有效的治療手段。本論文中我們將重點(diǎn)關(guān)注DRG局部GABA系統(tǒng)在慢性神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和治療中的作用。
　　首先，為了研究DRG局部GABA系統(tǒng)在疼痛發(fā)生過(guò)程中的作用，我們建立了一

3、個(gè)全新的“sniffer patch”電生理實(shí)驗(yàn)方法，證明大鼠 DRG神經(jīng)元在興奮情況下可直接釋放GABA，這為DRG局部存在功能性的GABA系統(tǒng)提供了更直接的證據(jù)。其次，我們通過(guò)制備大鼠坐骨神經(jīng)慢性擠壓損傷（CCI）神經(jīng)病理性疼痛模型，觀察疼痛進(jìn)展期DRG神經(jīng)元GABA電流密度的改變，以研究DRG局部GABA系統(tǒng)在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生中的作用。最后，我們通過(guò)滲透泵靶向DRG給藥系統(tǒng)，觀察GABA對(duì)神經(jīng)性病理性疼痛反應(yīng)的影響，分析DRG局

4、部GABA系統(tǒng)作為慢性神經(jīng)病理性疼痛治療靶點(diǎn)的可能性。
　　第一部分：通過(guò)“Sniffer Patch”方法證明DRG神經(jīng)元的GABA釋放功能
　　目的：
　　建立一種全新的電生理實(shí)驗(yàn)方法“sniffer patch”，證明DRG神經(jīng)元具有直接釋放GABA的功能。
　　方法：打孔“sniffer patch”電生理實(shí)驗(yàn)方法，半定量 PCR技術(shù)VGAT-ChR2-YFP小鼠鑒定，冰凍切片-免疫熒光技術(shù)，統(tǒng)計(jì)方法為t

5、檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　?、偎幬锎碳?DRG神經(jīng)元“Sniffer Patch”結(jié)果：將表達(dá)有GABAA受體的HEK293B細(xì)胞與大鼠急性分離DRG細(xì)胞共培養(yǎng)，與小直徑DRG緊密相鄰的轉(zhuǎn)染了GABAA受體的HEK293B細(xì)胞在200μM GABA作用下產(chǎn)生很大的GABA-Cl-電流。而當(dāng)給予TRPV1受體的激動(dòng)劑辣椒素激活小直經(jīng)DRG神經(jīng)元，用sniffer patch的方法在相鄰HEK293B細(xì)胞記錄到類似的GABA樣電流。

6、而辣椒素不能誘發(fā)單獨(dú)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染了GABAA受體的HEK293B細(xì)胞，以及與DRG共培養(yǎng)的空白HEK293B細(xì)胞產(chǎn)生任何電流。
　?、跈C(jī)械刺激DRG神經(jīng)元的“Sniffer Patch”結(jié)果：GABAA受體轉(zhuǎn)染HEK293B細(xì)胞與大鼠DRG細(xì)胞共培養(yǎng)，給予表達(dá)有GABAA受體的HEK293B細(xì)胞緊密相鄰的小直徑DRG機(jī)械刺激，未能誘發(fā)HEK293B細(xì)胞產(chǎn)生GABA樣電流。
　?、酃饧せ頥GAT-ChR2-YFP小鼠DRG神經(jīng)元

7、的“SnifferPatch”。
　　結(jié)果：
　　分離VGAT-ChR2-YFP小鼠DRG細(xì)胞，如上述方法進(jìn)行共培養(yǎng)，在473nm激光刺激下，在與轉(zhuǎn)基因小鼠VGAT-ChR2-YFP的DRG緊密相鄰的表達(dá)有GABAA受體的HEK293B細(xì)胞記錄到一個(gè)小的內(nèi)向電流，比在單獨(dú)培養(yǎng)的表達(dá)有GABAA受體的HEK293B細(xì)胞，以及與野生型小鼠的DRG緊密相鄰的表達(dá)有GABAA受體的HEK293B細(xì)胞記錄的電流大，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

8、br>　　結(jié)論：
　　大鼠DRG神經(jīng)元在capsaicin刺激下可直接釋放GABA，轉(zhuǎn)基因小鼠VGAT-ChR2-YFP的DRG神經(jīng)元在473 nm激光刺激下也有類似GABA釋放現(xiàn)象，從而證實(shí)了DRG神經(jīng)元具有直接釋放GABA的功能。為DRG局部存在功能性的GABA系統(tǒng)提供了更直接的證據(jù)。
　　第二部分：DRG部位GABA系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的影響
　　目的：
　　研究CCI手術(shù)后不同直徑大小DRG神經(jīng)元的GAB

9、A電流密度的改變。采用滲透泵靶向DRG給藥的給藥方法，觀察DRG局部GABA系統(tǒng)對(duì)病理性疼痛的治療作用。
　　方法：
　　制備神經(jīng)病理性模型CCI；應(yīng)用Von Frey纖維刺痛針和熱刺痛儀，測(cè)定大鼠機(jī)械痛、熱痛閾值；建立滲透泵靶向 DRG給藥系統(tǒng)；全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)；統(tǒng)計(jì)方法為兩個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney Test。
　　結(jié)果：
　?、貱CI模型建立：CCI組出現(xiàn)明顯的痛覺(jué)過(guò)敏癥狀，其機(jī)械痛和熱

10、痛閾值在術(shù)后第一天明顯下降，并持續(xù)至第十四天，與對(duì)照組比存在顯著性差異（P＜0.05）。
　　②電生理結(jié)果：用電生理技術(shù)分別記錄大鼠CCI手術(shù)后第五天和第十四天的術(shù)側(cè)和對(duì)側(cè)大鼠大、中、小直徑L4-6DRG神經(jīng)元的GABA-Cl-電流。大直徑和小直徑L4-6DRG神經(jīng)元CCI術(shù)后第五天、第十四天術(shù)側(cè)DRG神經(jīng)元的電流密度和對(duì)GABA的反應(yīng)數(shù)目與對(duì)側(cè)DRG神經(jīng)元無(wú)明顯區(qū)別。中等直徑L4-6DRG神經(jīng)元在CCI術(shù)后第五天大鼠術(shù)側(cè)的DRG

11、神經(jīng)元GABA-Cl-電流密度大于對(duì)側(cè)（P＜0.05），而第十四天術(shù)側(cè)與對(duì)側(cè)無(wú)顯著區(qū)別。第五天和第十四天對(duì)側(cè)的DRG神經(jīng)元對(duì)GABA有反應(yīng)的神經(jīng)元數(shù)目遠(yuǎn)少于術(shù)側(cè)。
　?、坌袨閷W(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：通過(guò)滲透泵靶向DRG給藥系統(tǒng)對(duì)CCI模型大鼠部位持續(xù)給予GABA（200μM）一周，對(duì)照組給予生理鹽水；在術(shù)前及術(shù)后第1，5，7，10，14天進(jìn)行機(jī)械痛和熱痛實(shí)驗(yàn)的測(cè)定。結(jié)果顯示GABA的應(yīng)用可使術(shù)后第一和第五天熱痛閾值明顯增大（P＜0.05），而