DNA甲基化在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛由神經(jīng)系統(tǒng)的損害或炎癥引起，是一種常見而特殊的慢性疼痛，以痛覺過敏、異常痛敏和自發(fā)痛為特征。目前發(fā)病機(jī)制不清，發(fā)病率逐年上升，處理非常棘手而且目前的治療方法療效不佳，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的挑戰(zhàn)性研究課題。眾多研究表明外周和中樞敏化在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用。外周和中樞敏化均與初級感覺神經(jīng)元、次級感覺神經(jīng)元以及膠質(zhì)細(xì)胞上疼痛相關(guān)分子和受體基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的改變密切相關(guān)。
　　 表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變

2、化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，主要體現(xiàn)在DNA堿基上發(fā)生的甲基化修飾、染色質(zhì)重塑、基因印記、X-染色體失活以及非編碼RNA調(diào)控等方面。其中DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)又普遍存在的基因表觀修飾方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA高甲基化能關(guān)閉相關(guān)基因的活性，去甲基化則可以誘導(dǎo)基因的重新活化和表達(dá)。于是推測，表觀遺傳學(xué)機(jī)制尤其是DNA甲基化機(jī)制很可能參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展。相關(guān)研究較少，本課題的開展和順利完成可為神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)

3、制和治療研究提供新的思路和方向。
　　 研究目的：
　　 觀察總體DNA甲基化水平在坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronicconstriction injury，CCI)大鼠脊髓腰膨大中的變化;觀察DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs) DNMT1、DNMT3a和DNMT3b及甲基化CpG連接蛋白2(methyl-CpG-binding protein2，MeCP2)在CCI大鼠脊髓

4、腰膨大中表達(dá)的變化;觀察神經(jīng)病理性疼痛重要相關(guān)因子谷氨酸脫羧酶67(glutamate decarboxylase67，GAD67)在CCI大鼠脊髓腰膨大中表達(dá)的變化及其編碼基因GAD1啟動子甲基化水平在CCI大鼠脊髓腰膨大中的變化;采用DNMT特異性抑制劑5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-AZA）鞘內(nèi)注射，觀察其對CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)作用，探索神經(jīng)病理性疼痛的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制。
　　 研究方法：

5、>　　 1.雄性Sprague-Dawley(SD)成年大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)和CCI組，測量各組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閡基礎(chǔ)值后，參考Bennett和Xie等的方法構(gòu)建大鼠左側(cè)CCI模型;sham組進(jìn)行同樣的手術(shù)，暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎。分別于術(shù)后第3、5、7、10、14天再次測定各組大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾。各組大鼠術(shù)后14天測試完畢后于深麻醉下處死，取脊髓腰膨大段測定其總體DNA甲基化水平。
　　 2.Sham組和C

6、CI組大鼠術(shù)后14天測試完畢后于深麻醉下處死，取脊髓腰膨大段采用免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)和蛋白印跡(westernblot)方法檢測其DNMT1、DNMT3a、DNMT3b及MeCP2的表達(dá)。
　　 3.Sham組和CCI組大鼠術(shù)后14天測試完畢后于深麻醉下處死，取脊髓腰膨大段采用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(

7、real-timequantitative RT-PCR，qRT-PCR)方法檢測其GAD67 mRNA的表達(dá)，采用焦磷酸測序方法檢測其編碼基因GAD1啟動子區(qū)域的甲基化水平。
　　 4.腰段鞘內(nèi)置管成功的雄性SD成年大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)+生理鹽水組（sham+NS組）、CCI+生理鹽水組（CCI+NS組）、CCI+5-AZA10μM組（CCI+5-AZA組）。術(shù)后第3天開始鞘內(nèi)注射NS或5-AZA10μM（溶于NS），每天

8、一次，每次10μl，持續(xù)至第14天。分別于術(shù)前及術(shù)后第3、5、7、10、14天測定大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾，術(shù)后14天測試后于深麻醉下處死取脊髓腰膨大段行總體DNA甲基化水平，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2的表達(dá)，GAD67的表達(dá)及GAD1基因啟動子區(qū)域的甲基化水平等相關(guān)檢測。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.術(shù)前兩組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾無明顯差別(P＞0.05)，術(shù)后第3天，CCI組機(jī)械痛閾和熱痛閾較sh

9、am組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，于術(shù)后第7天降至最低點(diǎn)(P＜0.05)，并持續(xù)至第14天(P＜0.05)。脊髓腰膨大處總體DNA甲基化水平測定，顯示術(shù)后14天CCI組較sham組總體DNA甲基化水平明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.術(shù)后14天，RT-PCR的結(jié)果顯示，較sham組比較，CCI組大鼠脊髓腰膨大處DNMT1 mRNA表達(dá)無明顯改變(P＞0.05)，DNMT3a、DNMT3b和M

10、eCP2的mRNA表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，CCI大鼠的脊髓腰膨大處細(xì)胞核內(nèi)的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2蛋白表達(dá)較sham組均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。脊髓腰膨大處免疫組化顯示DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2陽性細(xì)胞均以灰質(zhì)表達(dá)為主，于灰質(zhì)全層均有較多表達(dá)，在脊髓背角致密表達(dá)。陽性顆粒主要位于胞核，胞漿可見少量表達(dá)。CC

11、I組脊髓背角處DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2的陽性表達(dá)較sham組明顯增多。
　　 3.術(shù)后14天，脊髓腰膨大處，qRT-PCR方法顯示CCI組大鼠GAD67 mRNA的表達(dá)明顯低于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，焦磷酸測序方法顯示GAD1基因啟動子區(qū)域的甲基化水平明顯高于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.CCI+5-AZA組較CCI+NS組從術(shù)后5天（鞘內(nèi)給藥2

12、天后）起機(jī)械痛閾和熱痛閡明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并持續(xù)至術(shù)后14天(P＜0.05)。術(shù)后14天，脊髓腰膨大處，CCI+5-AZA組較CCI+NS組比較，總體DNA甲基化水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);DNMT1 mRNA表達(dá)無明顯改變(P＞0.05)，DNMT3a、DNMT3b和MeCP2的mRNA表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，細(xì)胞核內(nèi)的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和Me

13、CP2蛋白表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); GAD67的mRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，GAD1基因啟動子區(qū)域的甲基化水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HE染色顯示鞘注5-AZA10μM未對大鼠脊髓組織產(chǎn)生明顯的損害。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.CCI大鼠脊髓腰膨大處總體DNA甲基化水平明顯上升，并與CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛行為學(xué)變化相平行，提示脊髓腰膨大處總體D

14、NA甲基化水平的異常增加很可能在CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制中起重要作用。
　　 2.DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2在CCI大鼠脊髓腰膨大處表達(dá)均明顯上調(diào)，并與CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛行為學(xué)變化相平行，提示脊髓腰膨大處DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2表達(dá)上調(diào)很可能協(xié)同參與了CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展。
　　 3.GAD67 mRNA在CCI大鼠脊髓腰膨大表達(dá)明顯下降，其編

15、碼基因GAD1啟動子區(qū)域甲基化水平明顯增加，并與CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛行為學(xué)變化相平行，提示GAD67表達(dá)下調(diào)及GAD1啟動子甲基化水平增加很可能在CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　 4.鞘內(nèi)注射5-AZA10μM可以明顯緩解CCI大鼠的神經(jīng)病理性疼痛，并能在脊髓腰膨大處降低總體DNA甲基化水平，抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和MeCP2的表達(dá)，上調(diào)GAD67的表達(dá)，降低GAD1啟動子甲基化水平