脊髓NG2細胞在大鼠神經(jīng)病理性疼痛中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic pain)是神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的一種難以治療的慢性狀態(tài)，國際疼痛研究協(xié)會（IASP,1994)稱之為“由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接損傷或功能紊亂引起的疼痛”。感染、創(chuàng)傷、代謝性疾病、腫瘤化療、手術(shù)、射線、神經(jīng)毒性藥物、神經(jīng)受壓缺血、炎癥和腫瘤的侵襲都可引起神經(jīng)病理性(中樞性和周圍性)疼痛。
　　 急性疼痛對機體具有警示和“保護”作用，而神經(jīng)病理性疼痛與之不同，它可以

2、持續(xù)存在，對機體無益，甚至?xí)?yán)重影響生活質(zhì)量。神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生機制十分復(fù)雜，從神經(jīng)損傷（傷害性刺激）到疼痛產(chǎn)生，會在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生一系列的變化。脊髓是疼痛信息傳遞和整合的初級中樞，脊髓背角匯聚著來自外周的不同傳入神經(jīng)與來自腦干和大腦皮質(zhì)的下行投射神經(jīng)，加上背角局部中間神經(jīng)元，組成十分復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并含有非常豐富的生物活性物質(zhì)，因此，脊髓在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。
　　 傳統(tǒng)觀點認為神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要

3、的信號細胞，而膠質(zhì)細胞僅僅是起絕緣、營養(yǎng)與支持作用，因此，以往在對疼痛的研究中大量的實驗關(guān)注于神經(jīng)元的功能。
　　 但近年來發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細胞在疼痛的產(chǎn)生與發(fā)展過程中起重要的作用。Colburn等首次提出小膠質(zhì)細胞的活化出現(xiàn)在疼痛的起始階段,而星型膠質(zhì)細胞在疼痛的發(fā)展和持續(xù)階段有很強的活化反應(yīng)。外周神經(jīng)損傷后初級傳入神經(jīng)纖維中樞端釋放P物質(zhì)（substance P,SP）、興奮性氨基酸（Excitatory amino acids，

4、EAAs）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）等，作用于脊髓膠質(zhì)細胞的受體，膠質(zhì)細胞激活后產(chǎn)生和釋放大量疼痛相關(guān)介質(zhì)，如細胞因子、炎性介質(zhì)和神經(jīng)活性物質(zhì)等。過量的這些物質(zhì)積聚又能敏化神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，最終造成疼痛信號的產(chǎn)生和擴大，使病理性疼痛進一步發(fā)展和持續(xù)。
　　 近年來，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了一類兼具神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞特性的細胞，這類細胞表面特異性表達硫酸軟骨素蛋白多糖NG2，被稱為NG2細胞。新

5、近的研究認為它是繼少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞后的又一類“新型”膠質(zhì)細胞系，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的灰質(zhì)與白質(zhì)中。在對NG2細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，在多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷與疾病過程中可出現(xiàn)NG2細胞的活化，主要表現(xiàn)為胞體增大，突起增多，NG2分子表達增多。在海馬區(qū)NG2細胞與興奮性神經(jīng)元或抑制性神經(jīng)元均可形成突觸聯(lián)系，NG2細胞膜表面的AMPA受體和GABAA 受體參與了由神經(jīng)元到NG2細胞的信息傳導(dǎo)。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程中NG2細胞可產(chǎn)

6、生和釋放多種神經(jīng)興奮性物質(zhì)。此外，研究發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激小膠質(zhì)細胞活化時可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞表達NG2分子及炎性介質(zhì)，RNA干擾下調(diào)NG2分子的表達后，小膠質(zhì)細胞活化表達的炎性介質(zhì)下調(diào)。上述研究提示NG2細胞在神經(jīng)活動（包括疼痛的發(fā)生發(fā)展）中可能占據(jù)某種重要的地位，但由于對該細胞了解較晚，相關(guān)研究還處在初級階段。
　　 基于以上理論及研究基礎(chǔ)，本研究擬通過以下三部分的研究，來觀察慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓NG2細胞的變化及其參與疼痛的相

7、關(guān)機制：１：制作大鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛模型，觀察大鼠疼痛行為學(xué)的改變（包括機械刺激50％縮爪閾值和輻射熱刺激縮爪持續(xù)時間）及大鼠脊髓NG2細胞及NG2分子表達變化，初步探討NG2細胞在慢性神經(jīng)病理性疼痛中的的作用；2：體外培養(yǎng)大鼠NG2細胞，觀察其膜表面AMPA受體激活后NG2分子與疼痛相關(guān)介質(zhì)表達的變化；構(gòu)建大鼠NG2基因的shRNA 慢病毒載體，觀察RNA 干擾下調(diào)NG2分子表達后，NG2細胞AMPA 受體活化后疼痛相關(guān)介質(zhì)表達的改

8、變；3：將大鼠NG2基因的shRNA 慢病毒載體注射到慢性神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，觀察脊髓NG2細胞疼痛相關(guān)介質(zhì)表達的變化及其對疼痛的影響。
　　 研究方法與結(jié)果：1.慢性神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓NG2細胞及NG2分子表達的變化方法：選擇成年雌性Sprague-Dawlye 大鼠96只，體重220~250g，隨機分為三組，對照組（Na?ve組，n=24），不做任何處理；假手術(shù)組（Sham組，n=24），于大鼠背部切開皮膚

9、，分離肌肉直至L5橫突，咬開橫突，暴露L5脊神經(jīng)后縫合肌肉與皮膚；
　　 神經(jīng)病理性疼痛模型組（Spinal nerve ligation，SNL組，n=48)，于大鼠背部切開皮膚,分離肌肉直至L5橫突，咬開橫突，暴露L5脊神經(jīng)，用絲線結(jié)扎并剪斷L5脊神經(jīng)，縫合肌肉與皮膚。觀察術(shù)前、術(shù)后3d、7d、14d、21d、28d的術(shù)側(cè)后趾對機械刺激的50％縮爪閾值和輻射熱刺激的縮爪持續(xù)時間；于相同時點取脊髓腰膨大組織(每個時點隨機選擇4

10、只)，制作冰凍切片后作免疫熒光染色以觀察脊髓腰膨大背角組織中NG2細胞的改變；同時于相同時點提取SNL組大鼠術(shù)側(cè)脊髓腰膨大組織(每個時點隨機選擇4只)的蛋白質(zhì)，Western blot分析以檢測NG2分子的表達變化。
　　 結(jié)果：術(shù)前各組大鼠術(shù)側(cè)后肢機械刺激50％縮爪閾值與輻射熱刺激縮爪持續(xù)時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與術(shù)前相比，Na?ve組與Sham組大鼠各時點術(shù)側(cè)后肢機械刺激50％縮爪閾值與輻射熱刺激縮爪持續(xù)時間差

11、異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），SNL組大鼠術(shù)后3天開始各時點術(shù)側(cè)后肢機械刺激50％縮爪閾值明顯降低，輻射熱刺激縮爪持續(xù)時間明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與Sham組相比，SNL組大鼠術(shù)后3天開始各時點術(shù)側(cè)后肢機械刺激50％縮爪閾值明顯降低，輻射熱刺激縮爪持續(xù)時間明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，SNL組大鼠術(shù)后第7d、14d、21d 術(shù)側(cè)脊髓腰膨大背角組織中NG2細胞明顯活化，可見胞體增大

12、，突起增多。NG2細胞數(shù)目稍增多，但與術(shù)前相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；Western blot檢測結(jié)果顯示，SNL組大鼠術(shù)后第7d、14d、21d 術(shù)側(cè)脊髓腰膨大組織中NG2的表達量明顯增加，與術(shù)前相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　 2.體外培養(yǎng)NG2細胞表面AMPA 受體活化后疼痛相關(guān)介質(zhì)表達的改變方法：使用percoll不連續(xù)梯度離心法從Sprague-Dawlye大鼠乳鼠海馬中分離培養(yǎng)NG2細胞，免

13、疫熒光染色鑒定細胞性質(zhì)，流式細胞技術(shù)檢測細胞純度。構(gòu)建大鼠NG2基因的shRNA慢病毒載體LV-NG2-RNAi及對照慢病毒載體LV-Con-RNAi，并檢驗慢病毒載體的干擾效能。體外培養(yǎng)NG2細胞接種于6孔板中，分為三組：對照組（n=12）：不添加任何試劑；AMAP組（n=12）：加入AMPA受體激動劑AMPA0.5mM；AMPA+CNQX組（n=12）：同時加入AMPA受體激動劑AMPA0.5mM與AMPA受體拮抗劑CNQX50μM

14、。
　　 于加藥后1h、6h、12h、24h（每時間點3孔）使用Real-time PCR檢測細胞NG2分子、神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF與細胞因子IL-1β、TNF-α表達的變化。體外培養(yǎng)NG2細胞接種于6孔板中，分為兩組：對照組（n=3）：加入LV-Con-RNAi 4d后加入AMPA受體激動劑AMPA0.5mM；實驗組（n=3）：加入LV-NG2-RNAi 4d后加入AMPA受體激動劑AMPA0.5mM。于加藥后12h使用

15、Real-time PCR檢測細胞NG2分子、神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF與細胞因子IL-1β、TNF-α表達的變化。
　　 結(jié)果：成功體外分離培養(yǎng)了大鼠NG2細胞，細胞純度可達80％以上。構(gòu)建的慢病毒載體LV-NG2-RNAi的滴度可達8×108 TU/ml，干擾效率可達80％以上。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，NG2細胞表面AMPA受體活化后NG2、BDNF、NGF在給藥后1h、6h、12h、24h表達增高，與對照

16、組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；IL-1β在給藥后6h、12h、24h表達增高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；TNF-α在給藥后1h、6h、12h表達增高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。RNA干擾下調(diào)NG2分子表達后，Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，NG2細胞表面AMPA受體活化后NG2表達降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；BDNF、NGF、IL-1β、TNF-α

17、表達降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　 3.鞘內(nèi)注射NG2-shRNA慢病毒載體對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響方法：選擇成年雌性Sprague-Dawlye大鼠48只，體重220~250g，隨機分為四組：對照組（Na?ve組，n=12）；神經(jīng)病理性疼痛模型組（SNL組，n=12)；鞘內(nèi)注射LV-Con-RNAi后7d制備神經(jīng)病理性疼痛模型組（SNL+Con組，n=12)；鞘內(nèi)注射LV-NG2-RNAi后7d

18、制備神經(jīng)病理性疼痛模型組（SNL+NG2組，n=12)。術(shù)后7d使用western blot 檢測大鼠脊髓腰膨大組織NG2蛋白的表達；同時提取大鼠脊髓腰膨大組織中NG2細胞，使用流式細胞技術(shù)檢測NG2細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF與細胞因子IL-1β、TNF-α表達的變化；于術(shù)前、術(shù)后3d、7d、14d、21d、28d觀察術(shù)側(cè)后趾對機械刺激的50％縮爪閾值和輻射熱刺激的縮爪持續(xù)時間。
　　 結(jié)果：western blot 檢測

19、結(jié)果顯示，與Naive組相比，SNL組和SNL+Con組大鼠脊髓腰膨大組織中的NG2蛋白表達量增高（P<0.05），SNL+NG2組大鼠脊髓腰膨大組織中的NG2蛋白表達量無明顯改變（P>0.05）。流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，與Na?ve組比較，SNL組和SNL+Con組大鼠脊髓腰膨大組織NG2細胞BDNF、NGF表達增多，但SNL+NG2組大鼠脊髓腰膨大NG2細胞BDNF、NGF表達無明顯改變；與Na?ve組比較，SNL組、SNL+Co

20、n組和SNL+NG2組大鼠脊髓腰膨大組織NG2細胞IL-1β、TNF-α表達均增多。行為學(xué)觀察結(jié)果顯示，術(shù)前各組大鼠術(shù)側(cè)后肢機械刺激50％縮爪閾值與輻射熱刺激縮爪持續(xù)時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；SNL組與SNL+Con組大鼠從術(shù)后3天開始各時點術(shù)側(cè)后肢機械刺激50％縮爪閾值降低，與Na?ve組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；SNL+NG2組大鼠從術(shù)后14天開始各時點術(shù)側(cè)后肢機械刺激50％縮爪閾值降低，與Na?ve組比較差

21、異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。SNL組與SNL+Con組大鼠從術(shù)后3天開始各時點術(shù)側(cè)后肢輻射熱刺激縮爪持續(xù)時間增高，與Na?ve組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；SNL+NG2組大鼠從術(shù)后7天開始各時點術(shù)側(cè)后肢輻射熱刺激縮爪持續(xù)時間增高，與Na?ve組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　 4．統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量設(shè)計的方差

22、分析，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究總結(jié)：
　　 一、主要研究結(jié)果1．本研究通過疼痛行為學(xué)觀察確定成功構(gòu)建了大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型。免疫熒光染色顯示，大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型術(shù)側(cè)脊髓腰膨大背角組織中NG2細胞活化，表現(xiàn)為胞體增大，突起增多；Western Blot 檢測顯示，大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型術(shù)側(cè)脊髓腰膨大組織NG2分子表達增加。
　　 2．體外成功培養(yǎng)了大鼠NG2細胞

23、；大鼠NG2細胞表面AMPA 受體活化后NG2分子、神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF與細胞因子IL-1β、TNF-α表達增高；成功構(gòu)建了大鼠NG2基因的shRNA 慢病毒載體；RNA 干擾下調(diào)NG2分子表達后，NG2細胞表面AMPA 受體活化后BDNF、NGF、IL-1β、TNF-α表達均降低。
　　 3．鞘內(nèi)注射NG2-shRNA 慢病毒載體可以有效下調(diào)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓腰膨大組織中的NG2分子；RNA 干擾下調(diào)NG2分子表達

24、后神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓腰膨大NG2細胞的BDNF和NGF表達降低；延遲了神經(jīng)病理性疼痛大鼠術(shù)側(cè)后肢機械刺激50％縮爪閾值的下降和輻射熱刺激縮爪持續(xù)時間的增高。
　　 二、研究結(jié)論：
　　 1．神經(jīng)病理性疼痛大鼠術(shù)側(cè)脊髓腰膨大背角組織中NG2細胞活化，參與了疼痛的過程。
　　 2．體外培養(yǎng)大鼠NG2細胞表面AMPA 受體活化后NG2分子及疼痛相關(guān)介質(zhì)表達上調(diào)；NG2分子參與了大鼠NG2細胞表面AMPA 受體活化后

25、的信號傳導(dǎo)及基因表達的調(diào)控過程，影響疼痛相關(guān)介質(zhì)的表達。
　　 3．下調(diào)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓腰膨大NG2細胞的NG2分子表達可以下調(diào)NG2細胞BDNF和NGF的表達，延遲疼痛的發(fā)生。
　　 三、創(chuàng)新之處：
　　 1．近年來研究發(fā)現(xiàn)NG2細胞參與多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷與疾病過程。本實驗首次觀察了大鼠L5脊神經(jīng)結(jié)扎模型中脊髓腰膨大NG2細胞與NG2分子的改變，初步證實NG2細胞參與了疼痛的過程。
　　 2．文獻報

26、道NG2細胞表面AMPA 受體活化后，細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加，但并沒有相關(guān)實驗觀察其后的生物效能（包括基因表達變化）。本實驗觀察了AMPA 受體活化后神經(jīng)營養(yǎng)因子和細胞因子表達的改變，并且觀察了NG2分子表達與神經(jīng)營養(yǎng)因子和細胞因子表達之間的關(guān)系。
　　 四、展望：
　　 1．本研究發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的過程中脊髓NG2細胞活化，NG2分子參與了NG2細胞表面AMPA 受體活化后疼痛相關(guān)介質(zhì)表達的過程，但是NG2分子與