野菊花、漏蘆水提物對(duì)斑馬魚(yú)COX2-MMPs及ANGPT－TIE信號(hào)通路調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的：
　　中醫(yī)藥研究是一個(gè)值得深入開(kāi)發(fā)和探討的領(lǐng)域，抗腫瘤血管生成作為現(xiàn)在的一個(gè)研究熱點(diǎn)，從天然藥物中，尤其是現(xiàn)有中藥中尋找到抗腫瘤血管生成的藥物并發(fā)現(xiàn)其中的相關(guān)機(jī)制，成了新藥研發(fā)的一個(gè)新方向和熱點(diǎn)。野菊花和漏蘆作為清熱解毒法的代表藥物，廣泛運(yùn)用于臨床抗腫瘤的治療，在臨床運(yùn)用中已經(jīng)取很多抗腫瘤的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)支持，但對(duì)于這兩種中藥抗腫瘤血管生成的作用機(jī)制方面研究較少，且目前對(duì)于野菊花和漏蘆抑制腫瘤血管生成的報(bào)道僅限于以體外培養(yǎng)的

2、癌細(xì)胞株或是大鼠為觀察對(duì)象的實(shí)驗(yàn)研究，這兩種生物模型存在一定的局限性，不能系統(tǒng)并客觀地直接反映兩種中藥對(duì)血管生成的抑制效果。
　　血管熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的血管顯示更清晰，有利于視覺(jué)分析，便于對(duì)其體節(jié)間血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，進(jìn)而考察藥物的抑制血管生成作用。
　　本研究選擇fli1a-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，客觀直接地評(píng)價(jià)野菊花、漏蘆兩種中藥水提物抑制血管生成的效果，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)斑馬魚(yú)胚胎受到以上兩種中

3、藥處理后，COX2-MMPs及ANGPT-TIE信號(hào)通路中的主要基因的表達(dá)情況，探討野菊花、漏蘆兩種中藥抗血管生成作用的相關(guān)機(jī)制，為今后臨床上應(yīng)用野菊花、漏蘆治療腫瘤提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定野菊花和漏蘆兩種中藥水提物指紋圖譜，為之后幾部分的實(shí)驗(yàn)藥物的質(zhì)量提供了一個(gè)有效參考，保證了之后幾部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。
　　2、選用的fli1a-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)為生物模型，將180個(gè)2

4、2pdf轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎隨機(jī)分為空白對(duì)照組（0.1％DMSO）、陽(yáng)性對(duì)照組（瓦他拉尼，工作濃度為5μg/ml)、野菊花水提物組（工作濃度為200μg/ml）、漏蘆水提物組（工作濃度為200μg/ml），每組30個(gè)胚胎，在12孔板中實(shí)驗(yàn)。藥物干預(yù)26h后，將各組胚胎在體視顯微鏡(明場(chǎng))和體視熒光顯微鏡下進(jìn)行血管表型觀察和拍照，拍照時(shí)相為48hpf，以分析各組藥品對(duì)斑馬魚(yú)體節(jié)間血管（ISVs）生成的影響。完整的體節(jié)間血管（ISVs）是衡量斑

5、馬魚(yú)新生血管生成的重要指標(biāo)。
　　3、將72個(gè)22pdf轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎隨機(jī)分為空白對(duì)照組（0.1%DMSO）、瓦他拉尼組（工作濃度為5μg/ml)、野菊花水提物組（工作濃度為200μg/ml）、漏蘆水提物組（工作濃度為200μg/ml），每組18個(gè)胚胎，藥物干預(yù)26h后，將各組48hpf的斑馬魚(yú)胚胎勻漿處理，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組斑馬魚(yú)胚胎中COX2、MMP9、MMP2基因mRNA的表達(dá)，探討野菊花、漏蘆兩種中藥抗新

6、生血管生成作用的機(jī)制是否與COX2-MMPs信號(hào)通路有關(guān)。
　　4、將96個(gè)22pdf轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎隨機(jī)分為空白對(duì)照組（0.1%DMSO）、瓦他拉尼組（工作濃度為5μg/ml)、野菊花水提物組（工作濃度為200μg/ml）、漏蘆水提物組（工作濃度為200μg/ml），每組24個(gè)胚胎，藥物干預(yù)26h后，將各組48hpf的斑馬魚(yú)胚胎勻漿處理，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組斑馬魚(yú)胚胎中ANGPT1、ANGPT2b、TIE1、TIE

7、2基因mRNA的表達(dá)，探討醋野菊花、漏蘆兩種中藥抗新生血管生成作用的機(jī)制是否與ANGPT-TIE信號(hào)通路有關(guān)。
　　結(jié)果：
　　1、野菊花供試品7個(gè)共有峰中，峰3與對(duì)照品綠原酸相似，且相似度大于0.90，峰4與對(duì)照品木犀草苷相似，且相似度大于0.90；漏蘆供試品7個(gè)共有峰中，峰6與對(duì)照品蛻皮甾酮相似，且相似度大于0.90。
　　2、空白對(duì)照組斑馬魚(yú)胚胎的ISVs的熒光表達(dá)完整、清晰；與空白對(duì)照組相比較，陽(yáng)性對(duì)照組斑馬魚(yú)

8、胚胎的ISVs及DLAV的熒光表達(dá)完全消失，提示ISVs及DLAV的生成均被完全抑制；與空白對(duì)照組相比較，野菊花水提物組和漏蘆水提物組斑馬魚(yú)胚胎的ISVs的熒光表達(dá)部分消失，且僅能觀察到少量DLAV，提示野菊花水提物和漏蘆水提物能夠抑制斑馬魚(yú)胚胎的體節(jié)間血管及背部長(zhǎng)軸血管的生成。
　　3、野菊花水提物和漏蘆水提物均能夠顯著下調(diào)斑馬魚(yú)胚胎COX2的mRNA表達(dá)水平（P<0.01），但只有野菊花水提物能夠下調(diào)斑馬魚(yú)胚胎MMP2和MMP

9、9的mRNA表達(dá)水平（P<0.05）。瓦他拉尼對(duì)斑馬魚(yú)胚胎COX2、MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)水平均沒(méi)有明顯的影響。
　　3、野菊花水提物和漏蘆水提物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎ANGPT1的mRNA表達(dá)水平均沒(méi)有明顯的影響（P>0.05）,但漏蘆水提物能夠明顯上調(diào)斑馬魚(yú)胚胎TIE1的mRNA表達(dá)水平（P<0.05）；瓦他拉尼對(duì)斑馬魚(yú)胚胎中ANGPT1及TIE1的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯的影響；由于ANGPT2b和TIE2這兩個(gè)基因本身的表

10、達(dá)量極低，而這種極低的表達(dá)量用機(jī)器檢測(cè)的結(jié)果是不可信的，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中反復(fù)試用了幾對(duì)引物，但表達(dá)量仍極低，因此，對(duì)ANGPT2b和TIE2這兩個(gè)基因的數(shù)據(jù)予以淘汰，不計(jì)入本實(shí)驗(yàn)對(duì)比。
　　結(jié)論：
　　1、野菊花水提物和漏蘆水提物均具有抑制fli1a-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)新生血管的作用；
　　2、野菊花水提物抑制轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎新生血管生成的機(jī)制與下調(diào)COX2-MMPs信號(hào)通路從而抑制MMP9和MMP2的基因表達(dá)有關(guān)；