基于NRF2-ARE信號通路探討紅藤水提物對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用.pdf

1、目的：通過建立紅藤水提物的高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromaterygraphy，HPLC)的分析方法，采用人單核巨噬細(xì)胞U937細(xì)胞經(jīng)過脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激模擬疾病炎癥過程，觀察紅藤水提物的治療效果，探討紅藤水提物對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用，為臨床治療疾病提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　方法：⑴使用HPLC法檢測紅藤水提物中紅景天苷、蘆丁的含量，建立紅藤水提物成分的

2、HPLC分析方法，達(dá)到質(zhì)量控制目的。⑵采用LPS誘導(dǎo)模擬炎癥反應(yīng)，Real-time PCR法檢測NRF2及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10的mRNA表達(dá);Western Blot來檢測NRF2/ARE信號通路中NRF2、Keap1及HO-1和Akt/NF-κB信號通路中的NF-κB p65、IKK、IκB表達(dá)以及Akt、p38 MAPK、ERK1/2、JNK的活化水平;免疫熒光法檢測NRF2的核轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)果：①

3、HPLC法檢測紅藤水提物中的紅景天苷1.059 mg/g，蘆丁的含量為0.5611mg/g。②Real-time PCR法顯示，與對照組相比，LPS1μg/mL組中的炎性細(xì)胞因子因子TNF-α、IL-1β、IL-10表達(dá)上升;與LPS1μg/mL組相比，紅藤水提物干預(yù)后TNF-α、IL-1β、IL-10表達(dá)下調(diào)，呈濃度依賴性。③Western Blot法和Real-time PCR法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LPS1μg/mL組相比較，紅藤水提物

4、1 mg/mL和2 mg/mL干預(yù)后的NRF2，HO-1的表達(dá)增加，Keap1的表達(dá)明顯降低，呈濃度依賴。在1h、3h中，與對照組相比，LPS1μg/mL組的NRF2表達(dá)增加;與LPS1μg/mL組相比，紅藤水提物1 mg/mL組中的NRF2表達(dá)明顯減少;在6h、12h、24 h中，與LPS1μg/mL組對比，紅藤1 mg/mL組中的NRF2的表達(dá)量上升。在紅藤水提物干預(yù)24 h中，與LPS1μg/mL組相比較，紅藤水提物1 mg/mL

5、組中的Keap1表達(dá)減少，呈時(shí)間依賴性。在12h、24 h中，與LPS1μg/mL組對比，紅藤水提物1 mg/mL組的HO-1表達(dá)增加。在核轉(zhuǎn)位的實(shí)驗(yàn)中，觀察到LPS1μg/mL組中NRF2的核轉(zhuǎn)位明顯低于對照組和紅藤1mg/mL組。④Western Blot法顯示，與對照組相比，在3h、6h中，LPS1μg/mL組的NF-κB p65、IKK、IκB表達(dá)上調(diào);與LPS1μg/mL組相比，紅藤水提物1 mg/mL組的NF-κB p65、

6、IKK、IκB的表達(dá)下調(diào);在12h的LPS1μg/mL組和紅藤水提物1 mg/mL組的NF-κBp65、IKK、IκB的表達(dá)相反，即LPS模型組中NF-κB p65、IKK、IκB的表達(dá)下調(diào)，紅藤水提物組的表達(dá)增加。在LPS刺激的120 min中，與對照組相比，LPS1μg/mL組Akt的磷酸化水平增加;與LPS1μg/mL組相比，紅藤水提物1 mg/mL組Akt的磷酸化水平的下調(diào)，呈時(shí)間依賴性。⑤紅藤水提物干預(yù)的短時(shí)間中，Wester

7、n Blot結(jié)果顯示，在5 min、15 min、30 min、60 min、120 min中，LPS1μg/mL刺激后JNK、P38 MAPK的活化增加，紅藤水提物干預(yù)后JNK、P38 MAPK磷酸化水平降低。相反的是，紅藤水提物干預(yù)后ERK1/2的磷酸化水平升高。
　　結(jié)論：⑴確立了紅藤水提物的HPLC分析方法，測得紅藤水提物中的紅景天苷1.059mg/g，蘆丁的含量為0.5611mg/g。⑵紅藤水提物顯著抑制細(xì)胞炎性因子TN